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Aus dem Institut für Pathologie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. Alfred Christian Feller
Morphologische Analyse des Tumor-Mikromilieus von Kopf-Hals-Karzinomen
unter besonderer Berücksichtigung des HPV-Status
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- Aus der Sektion Medizin -
vorgelegt von Maximilian Philipp E. Gebhard
aus Hamburg
Lübeck 2014
ii
1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Christoph Thorns
2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Henning Frenzel
Tag der mündlichen Prüfung: 17.3.2015
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 17.3.2015
- Promotionskommission der Sektion Medizin -
iii
0 Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... 1
1 Einleitung und Fragestellung .............................................................................................. 2
1.1 Karzinome des Kopf-Hals-Bereiches ......................................................................... 2
1.2 HPV induzierte Onkogenese ...................................................................................... 3
1.3 HPV-Nachweis ........................................................................................................... 6
1.3.1 Virusnachweis ........................................................................................................ 6
1.3.2 p16ink4 ..................................................................................................................... 7
1.4 Prognose ..................................................................................................................... 9
1.5 Tumormikromilieu ..................................................................................................... 9
1.5.1 T-Lymphozyten .................................................................................................... 10
1.5.2 Makrophagen ........................................................................................................ 11
1.5.3 B-Lymphozyten .................................................................................................... 12
1.5.4 Plasmazellen ......................................................................................................... 12
2 Fragestellung .................................................................................................................... 12
3 Material und Methoden .................................................................................................... 13
3.1 Patientenkollektiv ..................................................................................................... 13
3.2 Gewebeproben .......................................................................................................... 13
3.3 Herstellung tissue-micro-array (TMA) ..................................................................... 14
3.4 HPV-Status ............................................................................................................... 15
3.4.1 p16-Immunhistochemie ........................................................................................ 15
3.4.2 in-situ-Hybridisierung .......................................................................................... 15
3.4.3 PCR ....................................................................................................................... 19
3.5 Immunhistochemie ................................................................................................... 20
3.5.1 CD3 ....................................................................................................................... 21
3.5.2 CD4 ....................................................................................................................... 21
3.5.3 CD8 ....................................................................................................................... 22
3.5.4 TIA ....................................................................................................................... 22
3.5.5 PGM-1 (CD68) ..................................................................................................... 22
3.5.6 PD-1 ...................................................................................................................... 23
3.5.7 CD38 ..................................................................................................................... 23
3.5.8 CD20 ..................................................................................................................... 23
3.5.9 CD23 ..................................................................................................................... 23
3.6 Mikroskopische Auswertung .................................................................................... 24
3.6.1 Auswertung der T-Lymphozyten und Makrophagen ........................................... 25
iv
3.6.2 Auswertung B-Lymphozyten und Plasmazellen .................................................. 25
3.6.3 Auswertung follikuläre Keimzentrumsreste ......................................................... 26
3.7 Statistik ..................................................................................................................... 26
4 Ergebnisse ......................................................................................................................... 26
4.1 HPV-Status ............................................................................................................... 26
4.2 T-Lymphozyten (CD3) ............................................................................................. 27
4.3 T-Helferzellen (CD4) ............................................................................................... 29
4.4 zytotoxische T-Lymphozyten (CD8) ........................................................................ 30
4.5 TIA ........................................................................................................................... 31
4.6 PD-1 .......................................................................................................................... 32
4.7 B-Lymphozyten (CD20) ........................................................................................... 33
4.8 Keimzentrumsfollikel (CD23) .................................................................................. 34
4.9 Plasmazellen (CD38) ................................................................................................ 34
4.10 Makrophagen (CD68) ............................................................................................... 35
5 Diskussion ........................................................................................................................ 37
5.1 HPV-Nachweis im Wandel der Zeit ......................................................................... 37
5.2 Unterschiede im Tumormikromilieu HPV-positiver und HPV-negativer
Plattenepithelkarzinome ........................................................................................... 39
5.3 PD-1 und therapeutische Perspektive ....................................................................... 40
5.4 Proliferationsfördernde Effekte des Tumormikromilieus......................................... 41
5.5 Einfluss der Strahlentherapie .................................................................................... 42
5.6 Limitationen der Arbeit ............................................................................................ 43
5.7 HPV-induzierte HNSCC sind eine eigene Entität .................................................... 44
6 Zusammenfassung ............................................................................................................ 45
7 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 46
8 Danksagungen .................................................................................................................. 52
9 Lebenslauf ........................................................................................................................ 53
10 Publikationsverzeichnis .................................................................................................... 54
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Abkürzungsverzeichnis
HPV = humanes Papillomavirus
HNSCC = englische Abkürzung für Plattenepithelkarzinome des Kopf- und Halsbereiches
AJCC = American Joint Committee on Cancer
TMA = englischsprachige Abkürzung für Paraffinmultiblock mit vielen Gewebeproben
HPF = englischsprachige Abkürzung für Gesichtsfeld bei größter Vergrößerung
pRb = Protein des Retinoplastoma-Gens
CDK = englischsprachige Abkürzung für Cyclin-abhängige Kinase (cyclin dependent kinase)
VEGF = englischsprachige Abkürzung für Gefäßendothel-Wachstumsfaktor
CIN = cervicale intraepitheliale Neoplasie
sIgA = sekrteorisches Immunglobulin A
HE = Hämatoxylin-Eosin-Färbung
DNA = englischsprachige Abkürzung für Desoxyribonukleinsäure
CISH bzw. ISH = (chromogene) in-situ-Hybridisierung
CRP = C-reaktives Protein
PD-L1 = Ligand zu PD-1
CUP = englischsprachige Abkürzung für Karzinom unbekannter Primärlokalisation
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1 Einleitung und Fragestellung
1.1 Karzinome des Kopf-Hals-Bereiches
Bei den sogenannten Karzinomen des Kopf-Hals-Bereiches handelt es sich um Karzinome der
Mundhöhle, Zunge, Larynx sowie des Naso-, Oro- und Hypopharnx. Überwiegend ausgehend
von den auskleidenden Schleimhäuten handelt es sich zu 90% um verhornende und nicht-
verhornende Plattenepithelkarzinome, die primär in den Fachgebieten Hals-Nasen-
Ohrenheilkunde und Mund-Kiefer-Gesichtschirurgie behandelt werden (Slootweg, 2005).
Dabei können in fortgeschrittenen Stadien die z.B. nach ICD-C gezogenen, anatomischen
Grenzen teils überlappen oder sind bei Rezidiven nach Voroperation verwischt (z.B.
Tonsillenkarzinom / Oropharynxkarzinom). Eine histologisch orientierte Organzuordnung
wird selten angewandt, z.B. in Karzinome des lymphoepithelialen Gewebes des
Waldeyer’schen Ranchenringes, welches die Karzinome des Zungengrundes und des
Oropharynx und Nasopharynx zusammenfassen würde existiert nicht. In der Literatur hat sich
der Begriff der Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches (englisch: head and neck
squamous cell carcinoma, abgekürzt HNSCC) etabliert. Die WHO-Klassifikation der Tumore
führt unter dem Plattenepithelkarzinom (ICD-O 8070/3) die Varianten verruköses Karzinom
(ICD-O 8051/3), basaloides Plattenepithelkarzinom (ICD-O 8083/3), papilläres
Plattenepithelkarzinom (ICD-O 8052/3), Spindelzellkarzinom (ICD-O 8074/3),
akantolytisches Plattenepithelkarzinom (ICD-O 8075/3) und das adenosquamöse Karzinom
(ICD-O 8560/3) auf. Diese Varianten sind selten und weisen eine ungleiche Verteilung
innerhalb der HNSCC auf. Davon abgegrenzt werden Adenokarzinome, die den kleinen
Speicheldrüsen zugerechnet werden. Die Karzinome der äußeren, teils UV-Licht-exponierten
Haut- und Hautadnexstrukturen gehören ebenfalls nicht in die Gruppe der HNSCC.
Für Deutschland lag die Inzidenz der Karzinome der Mundhöhle und des Rachens zwischen
1998 und 2002 bei etwa 20 pro 100.000 Einwohner und Jahr (Curado, 2007). Weltweit lag die
absolute Inzidenz im Jahr 2000 bei 389.650 Fällen von Mundhöhlen- und
Oropharynxkarzinomen sowie etwa 140.000 Fällen von Hypopharynx- und
Larynxkarzinomen. Das sind 5% aller Krebserkrankungen bei Männern und 2% bei Frauen.
Die durchschnittliche Überlebensrate nach 5 Jahren beträgt nur 50% (Black, 1997). Die
dominierenden Risikofaktoren für die Entstehung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-
Hals-Bereiches sind Alkoholkonsum und Rauchen, welche hier eine synergistische Wirkung
entfalten (Blot et al., 1988). Dies findet sich regelmäßig bestätigt und dient als Erklärung für
unterschiedliche Geschlechterverteilung, unterschiedliche weltweite Verteilung und
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unterschiedliche alters- und geschlechtsabhängige Dynamik auf Grund sich verändernder
soziokultureller Effekte und Prävention. Lokale Abweichungen zeigen, dass die
dominierenden Risikofaktoren aber auch andere sein können. Auf dem indischen
Subkontinent, Teilen Südostasiens, China und Taiwan sowie bei Emigranten aus diesen
Ländern sind Kautabak insbesondere in Kontamination mit Betelnuss, Areca-Nuss und
Kalziumhydroxid Hauptrisikofaktor für Mund-Rachenraumkarzinome (Johnson, 2005).
Die o.g. Risikofaktoren führen nicht zwangsläufig zu einem Karzinom. Viele
Zwischenschritte in der komplexen Onkogenese z.B. über Dysplasie sind reversibel (Schröder
und Gebhard, 2012).
1.2 HPV induzierte Onkogenese
Subjektiv auffällig ist eine Population jüngerer Patienten, die sich anamnestisch weniger den
Noxen Alkohol und Rauchen ausgesetzt hat (Prof. Wolfgang Steiner persönliche Mitteilung
2004). Neben o.g. exogenen Noxen und hier nicht diskutierten, epigenetischen und
genetischen Karzinogenesewegen, kann davon ausgegangen werden, dass etwa 15% aller
Krebserkrankungen nach Infektionen mit Parasiten, Bakterien oder Viren entstehen (zur
Hausen, 1999). Als Pionierleistung gilt die These Harald zur Hausens zur viralen Onkogenese
des Karzinoms der Zervix uteri durch das humane Papillomavirus (zur Hausen, 1976). Eine
Entdeckung, welche letztlich 2008 mit dem Nobelpreis geehrt wurde. Diese Onkogenese kann
auch für einen Teil der Plattenepithelkarzinome anderer Schleimhäute angenommen werden
(Scheurlen et al., 1986; zur Hausen, 1994; Burd, 2003). Es ist inzwischen anerkannt, dass eine
spezifische Subgruppe dieser HNSCC durch Infektionen mit humanen Papillomviren (HPV)
verursacht wird, wobei je nach Tumorlokalisation 20-30% der HNSCC auf eine HPV-
Infektion zurückgehen (Hoffmann et al., 1998). Bei Karzinomen des Oropharynx,
insbesondere des Waldeyer´schen Tonsillenrings aus Gaumen-, Zungengrund- und
Rachentonsille sind es sogar 50-60% . In einer aktuellen epidemiologischen Untersuchung in
2011/2012 aus acht onkologischen Zentren in Norddeutschland (Kiel, Lübeck, Rostock,
Greifswald, Hannover, Hamburg, Oldenburg und Köln) findet sich eine HPV-DNA-
Prävalenzrate von 23,5% in HNSCC, darunter 43,7% der Tonsillenkarzinome und 7,6% der
nicht-tonsillären Karzinomen (Quabius et al, Manuskript eingereicht). Die veröffentlichten
Prävalenzen des HP-Virus unterscheiden sich bisher erheblich (Chaturvedi, 2012).
Insbesondere unterscheiden sich die Untersuchungsmethoden und Befundinterpretationen, die
Lokalisationen und Sublokalisationen, die Patientenkollektive nach übrigen Risikofaktoren
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und nicht zuletzt die Länder und kulturellen Faktoren, was Vergleichbarkeit und Metaanalyse
erschwert.
Die Patientenpopulation, die nicht regelmäßig Alkohol konsumiert und raucht, häufig jünger
und häufiger weiblich oder homosexuell ist, rückte hier in den Fokus. Dafür dass die HPV-
induzierte Onkogenese ein von den Hauptrisikofaktoren Rauchen und Alkohol unabhängiger
Faktor ist, spricht die fehlende Korrelation zwischen gesteigertem Alkohol-und Tabakkonsum
und Karzinomrisiko bei HPV16-seropositiven Patienten (Applebaum et al., 1997).
Das humane Papillomavirus ist ein unbehülltes, doppelsträngiges DNA-Virus mit einer Größe
von etwa 8.000 Basenpaaren, welches verhornendes und unverhornendes Plattenepithel von
Haut und Schleimhäuten infiziert und dort zu klinisch erkennbaren Läsionen führen kann.
Infektionen mit HP-Viren sind weit verbreitet und wahrscheinlich wird jeder Mensch vielfach
infiziert. Dennoch treten klinisch bedeutsame Läsionen vergleichsweise selten auf. Die
Infektion verläuft häufig selbstlimitierend und wird als latente Infektion beschrieben. Die in
der Epithelzelle als episomale DNA vorliegenden Erbinformationen des Virus, werden mit
Hilfe des Syntheseapparates der Wirtszelle massenhaft repliziert. In der Histopathologie fallen
dann bereits im Routine-HE-Schnitt sogenannte Koilozyten auf (vgl. Abbildung 11). Dies
sind Keratinozyten mit perinukleären Inklusionen voll von neuer Virus-DNA und mit leicht
atypischen Zellkernen auf Grund der aktivierten DNA-Replikation. Diese sind typisches
Merkmal benigner Tumoren, nämlich der Verrucae. Auf den ringförmigen Episomen finden
sich 8 Gene. Die in einem frühen („early“) Stadium relevanten Gene werden E1, E2, E4, E5,
E6 und E7 benannt, während die zwei in späteren („late“) Stadien der Replikation relevanten
Gene L1 und L2 genannt werden. Die Gene E6 und E7 werden im physiologischen
Replikationszyklus des HP-Virus in den oberflächlichen Keratinozyten des Stratum spinosum
expremiert und wirken positiv auf die Regulation der Replikation. Im Replikationszyklus
werden die mit Viren beladenen Keratinozyten im Rahmen des physiologischen Zyklus des
Plattenepithels alsbald an der Oberfläche abgestoßen. Da superfizielle Keratinozyten bei
intakter Zellsteuerung nicht mehr proliferieren, scheint hier kein onkogenes Risiko zu
bestehen. Hingegen kann es in basalen, proliferierenden Stammzellen zu einer sogenannten
onkogenen Transformation durch die viralen, noch episomal lokalisierten Gene E6 und E7
kommen. Unter anderem führt E6 zu einer Degradierung des Tumorsuppressorproteins p53
und wird mittels weiterer Proteininteraktionen mit chromosomaler Instabilität assoziert. Ein
wichtiger Interaktionspartner von E7 ist das Protein des Retinoblastoma-Gens (pRb), welches
an zentraler Stelle im Zellzyklus den Übergang von der G1- zur S-Phase hemmt. Wenn E7 an
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hypophosphoryliertes, aktives pRb bindet, kommt es zur Freisetzung von
Transkriptionsfaktoren, darunter E2F, die den Zellzyklus in die S-Phase freigeben. Ein an
dieser Stelle ungeregelter Zellzyklus würde physiologisch auch durch p53 gehemmt werden,
welches aber wiederum durch E6 ausgeschaltet ist. Vermutlich dadurch und durch weitere
Proteininteraktionen wird eine chromosomale Instabilität mit Aneuploidie und
Chromosomenaberrationen betroffener, proliferationsaktiver Epithelzellen begünstigt. Im
Rahmen von DNA-Reparaturvorgängen kommt es schließlich zum Einbau der Virus-DNA in
das Wirtsgenom, so dass die protoonkogenen Virusgene E6 und E7 an verschiedenen Stellen
im Wirtsgenom bzw. in der Tumor-DNA mit jeder Zellteilung verbleiben (Duensing und
Münger, 2004; Wentzensen und von Knoebel-Döberitz, 2004; Trunk et al., 2005).
normales
Plattenepithel
Koilozytose
/ infiziertes Epithel
HPV-Infektion
Replikation
episomaler
HPV-DNA
low-grade
IEN
high-grade
IEN
dereguliertes
E6 / E7 in
Basalzellen
Integration
HPV-DNA in
Wirts-DNA
Abbildung 1: Skizze morphologischer Veränderungen von der HPV-Infektion zur onkogenen Transformation (modifiziert nach Wentzensen 2014 )
Da es eine massenhafte Durchseuchung mit HP-Viren gibt, aber relativ dazu nur wenige
Viren zu klinisch erkennbaren Läsionen führen und davon die meisten gutartiger Natur
(Verrucae, Papillome), wenige dysplastisch und reversibel sowie nur wenige bösartig sind,
verwundert es nicht, dass es Hochrisiko- und Niedrigrisiko-Typen der humanen
Papillomaviridae gibt. Es gibt mehr als 200 HPV-Typen. Aber etwa 80% der Karzinome der
Cervix uteri- und der Oropharynx-Karzinome weltweit sind mit den nur vier Hochrisiko-
Typen 16, 18, 31 und 45 assoziiert. Die über 200 verschiedenen HPV-Typen werden nach
Sequenzveränderungen innerhalb des L1-Gens unterschieden. Ein Pleomorphismus der
Nukleotidsäuresequenzen findet sich durchaus auch auf anderen Genabschnitten. Die
Unterteilung in Hochrisikotyp und Niedrigrisikotyp geschieht anhand der Häufigkeit des
Nachweises in Zervixkarzinomen. Daneben spielen epigenetische Faktoren des infizierten
Epithels eine entscheidende Rolle. In den basalen Epithelschichten ist die Zellproliferation
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ohnehin angeschaltet und es finden sich dort Stammzellen, während in oberen
Epithelschichten Ausdifferenzierung und Degeneration vorherrschen. Die
Transformationszone der Cervix uteri mit Differenzierung der Stammzellen in Plattenepithel
einerseits und Zylinderepithel andererseits ist eine besondere Zone für epigenetische
Mechanismen, u.a. DNA-Methylierung, Regulationsproteine und miRNA. Auch wenn die
genauen Mechanismen noch nicht bekannt sind, so ist es nicht verwunderlich, dass diese
Lokalisation und das lymphoepitheliale Gewebe des Waldeyer’schen Rachenringes zumindest
eine Sonderstellung für virusinduzierte Karzinome einnehmen. Das EBV-assoziierte
Karzinom des Nasenrachens ist ebenso an diese spezielle Lokalisation gebunden.
1.3 HPV-Nachweis
1.3.1 Virusnachweis
Zu unterscheiden ist der Virusnachweis aus dem unsterilen Speichel und Epithel der
auskleidenden Schleimhäute vom HPV-Gennachweis aus dem invasiven Karzinomgewebe
oder Metastasen. Da das humane Papillomavirus wie oben erwähnt ein unbehülltes DNA-
Virus ist, sind die Nachweismöglichkeiten beschränkt auf die episomale DNA, auf die in das
Wirtsgenom eingebauten Gene, auf RNA-Transkripte und das vom Gen L1 codierte
Kapsidprotein. Das Kapsidprotein dient in der gynäkopathologischen Abstrichdiagnostik der
Risikostratifikation. Das Kapsidprotein ist immunhistochemisch nachweisbar (Abbildung 11).
Ist dies der Fall, kann von einer Virusreplikation ausgegangen werden. Geringgradige
Dysplasien mit Nachweis des Kapsid bilden sich ganz überwiegend zurück, während eine
HPV-Infektion mit Verlust der Expression von Kapsidprotein in weniger als 15% eine
Rückbildung der Dysplasie erwarten lässt. Dies kann als Signal einer onkogenen Aktivierung
gewertet werden (vgl. Abbildung 1).
Die Virus-DNA kann mittels PCR, Sequenzierung oder in-situ-Hybridisierung aus
Frischmaterial und paraffineingebettetem Material nachgewiesen werden. Die mRNA-
Transkripte können mit rtPCT und in-situ-Hybridierung aus Frischmaterial nachgewiesen
werden. Die Proteine E6 und E7 sind immunhistochemisch in Paraffinmaterial nicht
nachweisbar (Ukpo et al., 2011).
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1.3.2 p16 ink4
Der immunhistochemische Nachweis des Proteins p16ink4 gilt als Surrogatmarker für eine
onkogene Transformation durch HPV. Bekannt wurde das 16kDa große Protein als ein
spezifischer Inhibitor der cyclinabhängigen Kinase 4 (cyclin dependent kinase 4, cdk4). Der
Zusatz „ink4“ steht für inhibitor of cyclin dependent kinase 4. Die cyclinabhängigen Kinasen
4 und 6 regulieren den Zellzyklus am Ende der G1-Phase. p16 kann anstelle von Cyclin-D
einen Komplex mit CDK4 bilden und stoppt den Zellzyklus am Übergang von der G1- in die
S-Phase. p16 gilt daher allgemein als Tumorsuppressor. Klinisch ist dies z.B. bei der Deletion
des p16-Gens in Pleuramesotheliomen oder in einigen Melanomen relevant. Während dort
aber das p16-Protein fehlt, kommt es in HPV-induzierten Karzinomen zu einer
Überexpression in den Tumorzellen, die immunhistochemisch messbar ist (Trunk et al.,
2005). Der o.g. physiologische Komplex aus pRb und dem Transkriptionsfaktor E2F wirkt
hemmend auf die Transkription des Gens des cyclinabhängigen Kinase-Inhibitors p16ink4.
Bindet statt E2F das virale E7 an pRb, dann entfällt diese Hemmung und es kommt zu einer
Überexpression von p16. Diese reichlich vorkommenden p16-Proteine können wiederum
nicht antionkogen wirken, da dazu ein intaktes pRb nötig wäre und nicht ein an E7
gebundenes pRb (Lukas et al., 1995).
Abbildung 2: Tonsille mit invasivem, diffus p16-positivem Karzinom (*) und mit nur fleckiger Reaktion im Kryptenepithel(§). Immunhistochemie. 10x Objektivvergrößerung entsprechend ca. 100x Vergrößerung am Okular.
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Abbildung 3: Vergrößerung aus Abb.2 Kryptenpithel mit sogenanntem patchy pattern der p16-Expression (braun) in nicht proliferierenden, superfiziellen, degenerativ veränderten Keratinozyten. Immunhistochemie mit Hämalaun-Kernfärbung (blau). 20x Objektiv
Abbildung 4: Vergrößerung aus Abb.1a. Karzinom mit durchgehender nukleärer und zytoplasmatischer, diffuser Reaktion (braun) auch proliferationsaktiver Zellen. Immunhistochemie mit Hämalaun-Kernfärbung 20x Objektiv
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1.4 Prognose
Patienten mit HPV-positiven HNSCC zeigen gegenüber HPV-negativen Karzinomen ein
besseres Ansprechen auf Radiochemotherapie mit längerem Gesamt- und rezidivfreiem
Überleben in den Stadien III und IV nach AJCC (Gillison, 2006; Fakhry et al., 2008; Ang et
al., 2010). Der HPV-Status ist die dominierende prognosedeterminierende Variabel noch vor
der Anzahl Packungsjahre Rauchen und dem Nodalstatus und Tumorstadium. Dies wird auf
eine höhere Strahlensensibilität der HPV-positiven Karzinomzellen zurückgeführt
(Rieckmann, 2013).
Auf Grund der unterschiedlichen Onkogenese und Prognose stellt das HPV-induzierte
Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereiches gegenüber den zumeist allein mit Rauchen
und Alkohol assoziierten Plattenepithelkarzinomen eine distinkte Entität dar. Daher ist es
hochinteressant, ältere Fragestellungen wieder aufzugreifen, die wegen der Vermengung
zweier unterschiedlicher Karzinomentitäten vielleicht gar nicht zu einem schlüssigen Ergebnis
kommen konnten.
1.5 Tumormikromilieu
Regelmäßig wiederkehrend stellt sich die Frage nach der Rolle des Immunsystems für die
Entstehung und die Prognose von Malignomen, aber auch als Ansatzpunkt für deren Therapie.
Zu unterscheiden sind Studien an zirkulierenden immunkompetenten Zellen und Zytokinen
von Rückschlüssen aus Zellkulturstudien sowie von in-situ histomorphologischen Analysen.
Zwar wurde bereits vor mehr als 20 Jahren beschrieben, dass plasmazytoide T-Zellen in
Lymphknotenmetastasen von Mammakarzinomen u.a. CD4 expremieren (Horny und Feller,
1987), aber viele der Studien zu Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches nutzen
immunologische Methoden am peripheren Blut. Klinische Studien zeigen, dass mittels
Stimulierung mit immunmodulatorischen Zytokinen, z.B. Interferon-α oder Interleukin-2 eine
Tumorregression erreichbar ist. So ist z.B. rekombinantes Interleukin-2 für die Therapie
metastasierter Nierenzellkarzinome und Melanome zugelassen (Hanahan und Weinberg,
2011). Zusätzlich gibt es den Effekt, dass ein Tumor selbst sein Mikromilieu prägt.
Vereinzelt wird dieses Mikromilieu auch Mikrobiom genannt. Vor dem Hintergrund hoher
Serumspiegel von C-reaktivem Protein (CRP) in HNPCC-Patienten, welche wohl am ehesten
einer häufig begleitenden Superinfektion zuzuordnen sind, ist auch eine autonome Expression
von C-reaktivem Protein durch HNPCC-Zelllinien nachweisbar (Frenzel et al., 2007). Die
virusinduzierte Kanzerogenese und die überwiegend im lymphoepithelialen Gewebe des
Oropharnx entstehenden HPV-induzierten HNSCC lassen nach einer spezifischen
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immunologischen Reaktion oder einer immunologischen Lücke fragen. Letztere deshalb, weil
geringgradige Dysplasien zumindest im Larynx und der Cervix uteri (CIN I) reversibel sein
können. IgA- und IgG- sowie lokale SIgA-Antikörper gegen HPV-Kapsidproteine konnten im
Serum und im Zervikalschleim betroffener Patientinnen nachgewiesen werden. HIV-
Patientinnen mit gestörter zellulärer Immunabwehr leiden häufiger als Gesunde an HPV-
Infektionen und HPV-induzierten Tumoren. Eine immunologische Studie an peripherem Blut
zeigte aktivierte, HPV-spezifische CD4- und CD8-positive T-Lymphozyten, welche bei
invasiven Karzinomen der Cervix uteri deutlich vermehrt waren im Gegensatz zu Patienten
mit intraepithelialer Neoplasie (Steele et al., 2005). Da HPV-induzierte Karzinome im
Gegensatz zu nicht-neoplastischen Körperzellen das Gen E6 und/oder E7 beinhalten bzw.
diese Proteine expremieren, ist das als ein attraktives Ziel für Vakzinierungsbehandlungen
vorstellbar. Im peripheren Blut lassen sich vermehrt E7-spezifische T-Lymphozyten
nachweisen (Albers et al., 2005). HNSCC mit vermehrter intratumoraler Infiltration durch
aktivierte (Koexpression von CD69) CD4-positive T-Lymphoyzten weisen eine bessere
Prognose hinsichtlich lokoregionärer Kontrolle und Gesamtüberleben auf (Badoual et al.,
2006).
1.5.1 T-Lymphozyten
T-Lymphozyten stammen aus dem Knochenmark und erlangen ihre immunologische
Funktionsfähigkeit während ihrer Ausreifung im Thymus. Sie tragen bestimmte CD-
Antigene, die die Unterscheidung funktioneller Untergruppen, z.B. CD4-positver Helfer-
/Induktor-Zellen von CD8-positiven Suppressor-/zytotoxischen T-Zellen erlauben. Als
Antigenrezeptor fungiert der aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzte T-Zell-
Rezeptor. Nach Antigenstimulation differenzieren sich T-Zellen über T-Immunoblasten in
Effektor- und Gedächtniszellen. Gleichzeitig findet eine Regulation speziell durch CD4-
positive Zellen statt. Die T-Zell-gebundene, zelluläre Immunabwehr erfolgt unter Vermittlung
von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (Makrophagen und dendritische Zellen).
Bei starker Stimulation von T-Zellen kann ihre Zahl stark zunehmen (Falk 1998).
CD4-positive T-Lymphozyten im peripheren Blut sind Gegenstand immunologischer Studien
zur körpereigenen Immunreaktion auf HNSCC (Badoual et al., 2010). Diese Population macht
45% der Lymphozyten im peripheren Blut aus.
CD8 wird auf NK-T-Lymphozyten und Thymozyten expremiert. CD8 fungiert als Corezeptor
in Verbindung mit dem T-Zellrezeptor zur Bindung an den MHC-Klasse-I-Komplex. Unter
anderem konnte eine Korrelation CD8-positiver Lymphozyten mit dem progressionsfreien
- 11 -
Überleben und dem Gesamtüberleben bei Ovarialkarzinomen gezeigt werden (Hamanishi et
al., 2007).
1.5.1.1 PD-1
PD-1 steht für „programmed death“ und wurde zuerst aus T-Lymphozyten isoliert, die einem
programmierten Zelltod unterlagen, und ist ein Mitglied der CD28-Rezeptorfamilie (Ishida et
al. 1992). PD-1 wird auf normalen T-Lymphozyten nur marginal, hingegen aber auf
aktivierten T- und B-Lymphozyten reichlich expremiert (Agata et al., 1996). PD-1 reduziert
die Aktivität des T-Zellrezeptors CTLA-4 oder führt zur Apoptose betreffender T-
Lymphozyten und bewirkt so eine Selbstregulation der T-Zellaktivität und periphere
Immuntoleranz. Mäuse ohne PD-1-Rezeptor entwickeln Autoimmunerkrankungen (Blank et
al. 2005). Die Aktivierung des PD-1-Rezeptor erfolgt durch Bindung mit dem auf manchen
Neoplasien und Stromazellen expremierten PD-Ligand. Diese Achse reduziert die
Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten im Mikromilieu von EBV-assozierten Hogdkin-
Lymphomen und inhibiert die induzierte Immunantwort (Vakzination) gegen Melanome
(Chetaille et al., 2009; Wang et al., 2009). Auf Ovarialkarzinomen ist die Expression von PD-
Ligand auf den Tumorzellen reziprok zur Infiltration von CD8-positiven T-Lymphozyten und
geht mit einer schlechteren Prognose einher (Hamanishi et al., 2007). In einem Mausmodell
der akuten myeloischen Leukämie führt die Bindung von PD-L1 an PD-1 zu einer
Tumorprogression (Zhang et al., 2009). Zusammenfassend führt die Interaktion von PD-1 mit
PD-L1 zu einer verminderten antitumoralen T-Zellantwort und einer schlechteren Prognose.
Antikörper gegen PD-Ligand haben das Potential einer therapeutischen Nutzung.
1.5.2 Makrophagen
Monozyten / Makrophagen finden sich in unterschiedlicher Dichte im lymphoepithelialen
Gewebe des Walder’schen Rachenringes. Sie spielen eine Schlüsselrolle in der Abwehr des
Organismus gegen pathogene Strukturen und in der Wundheilung. Als Teil der angeborenen
Immunabwehr phagozytieren die klassischen Makrophagen auch Tumorzellen und
präsentieren deren Antigene zwecks T-Zell-Aktivierung und wirken mit einer Reihe von
Zytokinen proinflammatorisch. Auf der anderen Seite wird in Malignomen auch eine weniger
bekannte Makrophagenfunktion analog den Wundheilungsprozessen beobachtet. Diese
tumorassozierten Makrophagen stimulieren Tumorangiogenese und -proliferation sowie
supprimieren eine adäuquate Immunantwort. Klinisch und experimentell sind Karzinome mit
- 12 -
dichter Infiltration durch Makrophagen assoziert mit einer schlechteren Prognose und
vermehrter Therapieresistenz (Allavena und Mantovani, 2012; Chanmee et al., 2014).
1.5.3 B-Lymphozyten
B-Lymphozyten stellen die Mehrheit der Zellen im regulären mukosaassozierten
lymphatischen Gewebe (MALT) des Epi- und Mesopharynx, des sogenannten
Waldeyer’schen Rachenringes. Ursprünglich wird B-Lymphozyten die Rolle zugeschrieben,
Antigene zu prozessieren, zu präsentieren und in Immunglobulin-produzierende Plasmazellen
oder B-Gedächtniszellen zu differenzieren. Ort der Proliferation und Differenzierung sind die
Keimzentren, die unmittelbar unter dem Kryptenepithel des MALT liegen (Falk 1998). Die
Rolle der B-Lymphozyten für die Antitumorimmunologie ist im Vergleich zu intratumoralen
oder peritumoralen T-Lymphozyten eher ungeklärt. Distel et al beschreiben in einer
Subgruppenanalyse, dass innerhalb einer Subpopulation von low-risk-Patienten mit geringen,
operablen Tumorstadien eine dichte Infiltration durch CD20-positve B-Lymphozyten mit
einer verbesserten Überlebensrate einhergehe. Innerhalb einer Hochrisiko-Patientengruppe
mit fortgeschritten Karzinomen findet sich hingegen eine signifikant geringere
Infiltrationsdichte von CD20-positiven B-Lymphozyten bei gleichzeitig vermehrt
intraepithelialen CD8-positiven, zytotoxischen T-Lymphozyten (Distel et al., 2009).
1.5.4 Plasmazellen
Unterschiedliche intraepitheliale bzw. intratumorale Infiltration von Läsionen der Mundhöhle
durch Plasmazellen wurden beschrieben und ein Zusammenhang mit der Karzinogese
diskutiert (Löning und Burkhardt, 1979).
2 Fragestellung
Mehrere Studien zeigen, dass HPV-induzierte Karzinome bezüglich Tumorprogression und
Therapieansprechen ein anderes biologisches Verhalten aufweisen. Einerseits stellt sich die
Frage, ob diese Karzinome eine immunologische Lücke im lymphoepithelialen Gewebe des
Waldeyerschen Rachenringes nutzen, und anderseits, ob Mechanismen der Immunantwort für
das bessere Therapieansprechen relevant sind. Die Definitionen des HPV-Status hat sich mit
dem Verständnis für die HPV-induzierte Onkogenese geändert. Die Methoden älterer
Arbeiten sind diesbezüglich kritisch zu reevaluieren. Zunächst stellt sich die Frage: Gehen
HPV-induzierte Kopf-Hals-Karzinome mit einem morphologisch anderen Mikromilieu einher
als nicht-HPV-induzierte Kopf-Hals-Karzinome?
- 13 -
3 Material und Methoden
3.1 Patientenkollektiv
Das untersuchte Patientenkollektiv umfasste 245 Patienten, die zwischen 2000 und 2009
wegen eines lokal fortgeschritten Plattenepithelkarzinoms des Kopf-Hals-Bereiches
(Mundhöhle, Pharynx, Larynx) in der Universitätsklinik für Strahlentherapie, Direktor Prof.
Dr. J. Dunst, Chefarzt Prof. Dr. med. Dirk Rades behandelt wurden. Die Patienten waren
Teilnehmer einer EORTC-Studie mit Karzinomen im Stadium III bis IV nach AICC. Die
Krankheitsverläufe mit den Parametern „metastasefreies Überleben“, „Gesamtüberleben“ und
„lokoregionäre Kontrolle“ waren bereits aus der Studie sowie der regulären Nachsorge nach
Bestrahlungstherapie bekannt und wurden bereits veröffentlicht (Rades et al., 2011). Aus dem
Kollektiv erhielten 93 Patienten zusätzlich zur Strahlentherapie eine Chemotherapie mit
Cisplatin. Retrospektiv wurde das Operationspräparat bzw. Tumorbiopsat untersucht, das im
Rahmen der Krankenversorgung am Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus
Lübeck, zur Routinediagnostik in das Institut für Pathologie eingesandt worden war. Die
Studie wurde der Ethikkommission der Universität zu Lübeck angezeigt und genehmigt.
3.2 Gewebeproben
Zu der EORTC-Studie gab es eine Klartextliste mit Namen und Geburtsdatum der Patienten.
Mit deren Hilfe wurde nach geeigneten Operationspräparaten im Befundauskunftsystem
Nexus/Paschmann der Pathologie recherchiert. Anhand der Pathologiebefunde wurden
Einsendungen aus der Zeit von vor der multimodalen Therapie ausgewählt, um potentiell
strahleninduzierte oder chemotherapieinduzierte Veränderungen auszuschließen. Nach
lichtmikroskopischer Reevaluation der alten Schnittpräparate wurden nicht-invasive
Epithelneoplasien (Dysplasie), nichtepitheliale Neoplasien und Lymphknotenmetastasen
(insbesondere solche mit unbekanntem Primärtumor) aus der Studie ausgeschlossen. Zu
kleine Proben wurden von der Studie ausgeschlossen, damit dadurch das Tumorgewebe nicht
für möglicherweise einmal therapeutisch relevante Untersuchungen unwiederbringlich
verloren gehe. Zudem lassen sich aus kleinen Biopsaten keine ausreichend langen
Gewebezylinder für das unten beschriebene TMA gewinnen. An den Schnittpräparaten
wurde eindeutiges, invasives Karzinomgewebe markiert. Die zugehörigen Paraffinblöcke mit
formalinfixierten und paraffineingebettetem Gewebe wurden aus dem Archiv des Institutes
herausgesucht. Das Paraffinmaterial stammte aus den Jahren 1998 bis 2008. Die
Formalinfixierung war mit gepuffertem, 4%igen Formalin (Formaldehyd) mit einer
- 14 -
Fixierungszeit von 6 bis 48 Stunden erfolgt. Die Entwässerung und Paraffineinbettung war
mittels aufsteigender Alkoholreihe und Xylol in Automaten über Nacht durchgeführt worden.
3.3 Herstellung tissue-micro-array (TMA)
Multigewebeblöcke, so genannte tissue microarrays (TMA), erlaubten verschiedene
Untersuchungen vieler Gewebeproben auf der Ebene der Proteine (Immunhistochemie) und
DNA mittels in-situ-Hybridisierung in nur einem Versuchsdurchgang. Die Erstellung der
TMAs erfolgte rein mechanisch. Aus konventionellen Paraffinblöcken (sog. Donorblöcke)
wurden mittels eines kommerziell erhältlichen Gerätes (sog. Arrayer) Gewebezylinder
entnommen und in einen neu zu erstellenden Paraffinblock (Rezipientblock = TMA-Block)
nach einem präzisen Schema eingebracht. Das Problem der intratumoralen Heterogenität war
durch die Verwendung von 2 - 3 Zylindern pro Tumor zu vernachlässigen (Horn, 2005). Vom
TMA-Block konnten dann multiple Schnitte mit einem Mikrotom angefertigt werden, die
dann für die weiteren Studien zur Verfügung standen. Dazu wurden im Rahmen der
mikroskopischen Untersuchung pro Fall zwei vitale, repräsentativ differenzierte
Tumorlokalisationen von jeweils etwa 3 mm Durchmesser auf dem Objektträger markiert.
Zudem reduzierte diese Vorgehensweise mögliche ethische Bedenken, da dadurch
Tumorgewebe der Patient gespart wurde und für potentielle klinische Fragestellungen weiter
zur Verfügung steht. Dieses Vorgehen wurde auch deshalb gewählt, weil es Ressourcen im
Labor und die Gesamtmenge der Antikörper sparte. Wesentlicher Vorteil waren gleichmäßige
immunhistochemische Untersuchungsergebnisse und die sich aus sich selbst ergebende on-
slide Kontrolle. Ein guter Kompromiss aus Stabilität der Donorblöcke, guter Schnittqualität,
ausreichender Morphologie und Effizienz erwies sich für TMA mit jeweils 6 x 7 Proben von
2 mm Durchmesser. Pro Tumor bzw. pro Patient wurden zwei Proben entnommen und in
zwei unterschiedliche TMA eingebracht. Die Entnahme der Tumorproben und Einbringung in
TMA erfolgte auf dem Manual Tissue Arrayer 1 (Beecher Instruments, Silver Spring, MD,
USA).
Abbildung 5
265 Patienten EORTC
davon 257 Patienten in Pathologie bekannt
davon in 245 Fällen Paraffin-blöcke vorhanden
davon 246 Fälle lichtmikroskopisch geeignet
- 15 -
Abbildung 6: a) links TMA-Paraffinblock b) rechts TMA-Schnittpräparat
3.4 HPV-Status
3.4.1 p16-Immunhistochemie
Die immunhistochemische Untersuchung auf eine aberrante Überexpression von p16 erfolgte
an 4µm dünnen Schnittpräraten der oben beschriebenen TMA. Verwendet wurde der
Antikörper p16ink4/MTS1 (Mitotic Inhibitor/Supressor Protein) Ab-4 der Firma Biocarta
Europe GmbH, Hamburg (Katalog-Nr. #04-10-7403, Bezeichnung des Clone: 16P04 oder
JC2). Dabei handelt es sich um einen monoklonalen Maus-Antikörper des
Immunglobulinsubtyp IgG1. Als Immunogen wurde laut Herstellerangabe aufgereinigtes,
humanes, rekombinantes p16-Protein der ganzen Länge verwendet. Der Antikörper Ab-4
weist keine Kreuzreaktivität mit den verwandten Proteinen p15ink4 und p18ink4 oder mit den
cyclinabhängigen Kinasen cdk4 und cdk6 auf.
Als positiv wurde nur eine durchgehende, zytoplasmatische und nukleäre Färbereaktion
proliferierender Karzinomzellen gewertet. Eine fokale positive Reaktion in Einzelzellen oder
kleinen Gruppen, oberflächlichlicher, atropher oder metaplastischer Zellen wurde zunächst als
„patchy pattern“ dokumentiert und im Verlauf dieser Arbeit als negativ gewertet (vgl.
Abbildungen 2-4) (Trunk et al., 2005).
3.4.2 in-situ-Hybridisierung
Tumorassoziierte HPV-DNA wurde primär mittels chromogener in-situ-Hybridisierung
nachgewiesen. Mit dieser Methode gelang der Nachweis geringer Mengen der Virus-DNA im
- 16 -
Tumorgewebe (Burns et al. 1987). Die Autoren gaben eine Genkopienzahl von unter 10 an. In
der in-situ-Hybridisierung fanden sich demnach in onkogen transformierten Tumorzellen
lediglich einzelne kleine Signale, die häufig eine Vergrößerung mit dem 40x Objektiv
(zuzüglich 10facher Okularvergößerung am Mikroskop entsprechend einer 400fachen
optischen Vergrößerung) erforderten. Es fanden sich ein bis drei kleine Signale einer
typischen mittelbraunen Signalintensität, -verteilung und -größe, wie sie aus der in-situ-
Hybridisierung mit nummerischen Sonden in der Routinediagnostik bekannt waren. Der
Autor und die Kollegen des Institutes für Pathologie verfügten hier über eine Expertise von
100 bis 200 Fällen für Her2neu pro Jahr mit Teilnahme an qualitätssichernden Ringversuchen
und externen Fortbildungen sowie mit Sonden für Alk1-EML4, MDM2, c-myc, bcl2 und
anderen. Dies erlaubte die Identifikation von Färbeartefakten, zum Beispiel bei
extranukleären Signalen im Rahmen unzureichender Waschschritte. Kaum wahrnehmbar
kleine Signale in weniger als 10% der Karzinomzellen galten als nicht eindeutig. Im
Zweifelsfall wurde als negativ klassifiziert. Innerhalb fortgeschrittener invasiver Karzinome
fand sich häufig nur noch die in das Wirtsgenom integrierte HPV-DNA mit dem oben oder in
Metastasen beschriebenem Signalmuster (Weichert et al., 2009). Demnach war explizit nicht
die aus einigen intraepithelialen Dysplasien der Cervix uteri und von Condylomata
accuminata (dort HPV-Subtypen 6 und 11) bekannte perinukleäre, intrazytoplasmatische,
massenhafte Ansammlungen von HPV-DNA alleiniges Kriterium eines positiven HPV-
Nachweises, da es sich dabei lediglich um episomale DNA handelte (vgl. Abbildung 10).
Die in-situ-Hybridisierung der formalinfixierten, paraffineingebetteten Tumorproben wurde
im Bond Autostainer mit den auf diesem System Gerät etablierten Analytika (BondTMReady-
to-use DNA ISH HPV Probe PB0820, Anti-Biotin antibody AR0584, Leica Biosystems,
Newcastle, U.K) durchgeführt. Bei dieser Untersuchung wurde DNA der HPV-Hochrisiko-
Subtypen 16,18,31,33 und 51 mittels entsprechender, komplementärer DNA-Sonden markiert.
Diese mit Biotin markierten Sonden wurden anschließend mit einem Anti-Biotin-Antikörper
detektiert und ermöglichten so eine Färbereaktion analog zur Immunhistochemie, welche im
Durchlichtmikroskop betrachtet werden konnte (vgl. Abbildungen 8 und 9).
- 17 -
Abbildung 7: invasives Plattenepithelkarzinom (mitte und links im Bild), welches Mukosa der Mundhöhle, Larynx oder Rachen aus nicht-verhornendem Plattenepithel unterminiert. Die Mukosa (rechter Bildrand) dient als Negativkontrolle. HE Orginalvergrößerung ca. 100x
Abbildung 8: chromogene in-situ-Hybridisierung mit Sonden gegen HPV der Subtypen 16, 18,31, 33 u. 51 in Form brauner nukleärer Signale (links). Gegenfärbung der Nuclei mit Hämalaun. Orginalvergrößerung ca. 100x.
- 18 -
Abbildung 9 : Ausschnitt aus b, Originalvergrößerung 400x: oben-links negative Stromazellen, unten-rechts Karzinom mit punktförmigen braunen Signalen
Abbildung 10: Plattenepithelkarzinom auf und Residuum hochgradiger Dysplasie mit reichlich episomaler HPV-DNA in einigen Nuklei (komplett braune Nuklei). Originalvergößerung 100x
- 19 -
Abbildung 11: Immunhistochemische Darstellung des HPV-Kapsidproteins (braun) in geringgradiger Dysplasie und Koliozytose (replikative Phase der Infektion). ca. 100x Orginalvergrößerung
3.4.3 PCR
Zur Etablierung der in-situ-Hybridisierung im Institutslabor und in Zweifelsfällen bei
fehlender Konkordanz zwischen p16-Expression und negativer in-situ-Hybridisierung wurde
HPV-DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und LCD-Array-Chip nachgewiesen
und eine Subtypisierung vorgenommen. Verwendet wurde das LCD-Array HPV3.5 der Firma
Chipron, Berlin. Zunächst erfolgte eine PCR unter Verwendung von zwei HPV-spezifischen,
biotinylierten Primermixturen (Pimer Mix A: My11/09 und Primer Mix B 125). Die dabei zu
erwartenden Amplikons hatten eine Länge von 430 und 125 Basenpaaren. Ein Teil des
Amplifikates wurde auf ein Agarosegel aufgetragen. Sofern sich die o.g. Banden ausbildeten,
waren Nukleinsäuren des HPV vorhanden. Zwecks Subtypisierung wurde das biotinylierte
PCR-Produkt auf einen Chip mit 32 Subtypen-spezifischen capture-Sonden aufgetragen. In
anschließender Hybridisierung konnten passende biotinylierte Amplifikate ausschließlich in
der Reaktionskammer binden, in der die passende subtypenspezifische capture-Sonde
adhärent war. Anschließend folgte ein Waschschritt, bei dem die ungebundenen
- 20 -
Komponenten entfernt wurden, und Zugabe eines Enzyms, mit dem das chromogene Substrat
der gebundenen Amplikons sichtbar gemacht wurde. Mittels eines SlideReaders genannten
Durchlichtscanners für die Arrays mit 92 Reaktionskammern wurde die Färbereaktion erfasst
und ein semiquantitatives Ergebnis dokumentiert. Es konnten folgende Subtypen
unterschieden werden: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 39, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62,
66, 67, 68, 70, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 90 und 91. Alle anderen Subtypen wären nur über den
Nachweis der eingangs genannten Amplikons von 430 und 125 bp Länge als HPV ohne
Subtyp nachweisbar.
3.5 Immunhistochemie
Von den in TMA zusammengefassten Tumorproben wurden 4 µm dünne Serienschnitte auf
beschichtete Objektträger (SuperFrost plus) aufgezogen, in Xylol entparaffiniert und in einer
absteigenden Alkoholkette rehydriert. Zur Antigendemaskierung wurde die in der Tabelle für
jeden Antikörper ausgetestete Vorbehandlung durchgeführt. Die endogenen Peroxidasen
wurden für 5 min in 6%igem Wasserstoffperoxid geblockt. Anschließend wurde der in der
Tabelle genannte Primärantikörper aufgebracht und inkubiert. Die Schnitte wurden mit TBS
(0.1% Tween 20, pH 7.0) gewaschen. Die weitere Reaktion erfolgte mit biotinfreier
Meerrettich-Peroxidase und Enzyme-markiertem Polymer des PowerVisionSystems
(ImmunoLogic, Duiven, Niederlande) und Diaminobenzidin-Komplex als Chromogen mit
einer braunen Farbe. Eine Gegenfärbung der Zellkerne erfolgte mit Hämatoxylin und ergab
eine blaue Färbung der Kerne.
Antikörper Klon Vorbehandlung Ver-
dünnung
Lieferant Bestell-Nr.
CD 68 PGM-1 Mikrowelle, 5´bei 850 W,
30´bei 150 W, Zitronensäure
(pH 6,0)
1: 50 Dako GmbH,
Hamburg
M0876
TIA TIA Dampftopf, 15´
Zitronensäure (pH 6,0)
1:50 Immunotech,
Marseille,
Frankreich
2550
PD-1 MRQ-22 EDTA 1:100 Cell Marque
Corporation,
USA
315M-95
- 21 -
3.5.1 CD3
Der CD3-Proteinkomplex wird auf T-Lymphozyten im Kortex und der Medulla des Thymus
expremiert. Er gilt als Pan-T-Lymphozentenmarker, da dieses Antigen bereits sehr früh in der
T-Zelldifferenzierung expremiert wird und auf der Oberfläche ruhender und aktivierter T-
Lympozyten erhalten bleibt. Er ist spezifisch für T-Lymphozyten und markiert nicht B-
Lymphozyten, Monozyten/Makrophagen, myeloische Zellen oder andere Zellen ausser einer
schwachen Expression auf Purkinjezellen des Kleinhirns und Hassal’schen Körperchen . Der
hier verwendetet Anti-CD3-Antikörper ist der Klon SP7. Es handelt sich um einen im
Kaninchen gebildeten Antikörper der Klasse IgG mit Reaktivität gegenüber humanem CD3,
welcher sehr gut paraffingängig ist und an die intrazytoplasmatische Komponente des CD3-
Moleküls bindet. Mikroskopisch findet sich eine Zytoplasma- und Membranfärbung.
3.5.2 CD4
Das CD4-Molekül ist ein transmembranöses Glykoprotein, das während der
Antigenerkennung mit HLA-Klasse-II-Rezeptoren interagiert. Es definiert die Untergruppe
der T-Helferzellen. CD4 findet sich zudem auf 80% der Thymozyten und auf einzelnen
Monozyten. CD4 wird außerdem auf Langerhans’schen Zellen und anderen dendritischen
Zellen, welche myeloischen Ursprungs sind, expremiert (Dabbs, 2008). Es wird eine
zytoplasmatische und membranöse Reaktion erwartet.
CD 3 SP7 Dampfgarer 25´,
Zitronensäure (pH 6,1),
1:200 NeoMarkers,
Fremont, CA
94539, USA
RM_9107_S
CD 4 lab 4B12 Dampfgarer, s.o. 1:50 Thermo Fisher
Scientific,
Cheshire WA7
1PR, UK
MS-1528- S
CD 8 lab BC/1A5 Dampfgarer
Decloaker pH 9,0
1:100 Biocare Medical,
Concord, CA
94520 USA
CM 154 C
CD 20 lab L26 Dampftopf, s.o. 1:200 NeoMarkers MS-340-S
CD 23 lab SP 23 Dampftopf, s.o. 1:100 NeoMarkers RM-9123-S
Tabelle 1 Antikörper
- 22 -
3.5.3 CD8
Der CD8-Rezeptor ist ein über Disulphidbrücken verbundenes α-β-Heterodimer oder α-α-
Homodimer und wird auf NK-T-Lymphozyten und Thymozyten expremiert. Das CD8-
Antigen definiert innerhalb der T-Lymphozyten sowohl die T-Suppressor- als auch die
zytotoxischen T-Zellen. Lediglich im Thymus tritt eine Koexpression von CD4 und CD8 auf.
In nicht-neoplastischen reaktiven, d.h. entzündlichen Lymphozyteninfiltraten findet sich ein
Verhältnis CD4 zu CD8 von etwa 2:1. Die hier zu detektierende Beta-Kette lässt in
formalinfixiertem Gewebe eine ähnliche hochsensitive Detektion zu wie in der
Durchflusszytometrie. Es wird eine zytoplasmatische und membranöse Reaktion erwartet
(Dabbs, 2008).
3.5.4 TIA
Auf Grund der Erstbeschreibung als granuläres Membranprotein mit einer Größe von 17 kDa
ist das T-Zell-limitiertes intrazelluläres Antigen (TIA-1) auch unter dem Synonym GMP-17
bekannt. Es ist ein Protein, dessen Expression mit zytotoxischen Granula assoziiert ist und
sich auf natürlichen Killerzellen (NK-T-Zellen) und zytotoxischen T-Lymphozyten (CD8+)
findet. Es findet sich im Zytoplasma zytolytisch aktiver T-Lymphozyten, Monozyten und
Granulozyten.
Bei dem von Immunotech erhältlichen Antikörper handelt es sich um einen aufgereinigten,
monoklonalen IgG-Maus-Antikörper gegen das humane T-Zell-limitierte intrazelluläre
Antigen (TIA). Verwendet wird der Klon 2G9. Die Spezifität in der Durchflusszytometrie
liegt bei 90% der CD16-positiven Zellen und 50-60% der CD8-positiven und weniger als
10% der CD4-positven Zellen.
3.5.5 PGM-1 (CD68)
CD68 wird in der allgemeinen histologischen Diagnostik zur Darstellung histiozytärer Zellen
eingesetzt. Es gehört zu einer Gruppe lysosomaler Glykoprotein-/Plasmamembran-Shuttle-
Proteinen, die eine Rolle bei der Endozytose spielen. CD68 wird reichlich in
zytoplasmatischen Granula von Monozyten und Makrophagen, aber auch in
zytoplasmatischen Granula neutrophiler und basophiler Granulozyten und großer
Lymphozyten expremiert. Der monoklonale Antikörper PGM1 ist mit Zellen aus einer Milz
mit Morbus Gaucher entwickelt worden. Dieser Antikörper ist an formalinfixiertem und
paraffineingebettetem Gewebe anwendbar und reagiert nicht mit Granulozyten und
myeloischen Vorläuferzellen. Die Spezifität wird lediglich durch eine positive Reaktion mit
- 23 -
Mastzellen und Synovia eingeschränkt, welche aber in der histologischen Untersuchung durch
den erfahrenen Pathologen leicht morphologisch kompensiert werden kann. Bei dem von
Dako gelieferten Antikörper handelt es sich um einen IgG-Maus-Antikörper.
3.5.6 PD-1
Bei dem verwendeten Antikörper PD-1 handelt es sich um einen IgG1-Antikörper. Das
erwartete Reaktionsergebnis ist zytoplasmatisch. In der menschlichen Tonsille wird PD-1 auf
einer kleinen Untereinheit der B-Blasten in den Keimzentren expremiert, so dass
Tonsillengewebe als Kontrolle mitgeführt wird (Iwai et al. 2002).
Eine in dieser Studie beobachtete, nukleäre Reaktion in Karzinomzellen wurde als
unspezifisch eingeordnet.
3.5.7 CD38
CD38 ist ein Oberflächenantigen, das auf Thymozyten, aktivierten T-Lymphozyten und
terminal ausgereiften B-Lymphozyten expremiert wird. In der pathologisch-anatomischen
immunhistochemischen Diagnostik ist Anti-CD38 ein bewährter Antikörper zur Darstellung
von Plasmazellen.
3.5.8 CD20
CD20 ist ein Kalziumkanal, der an der Aktivierung und Zellzyklussteuerung von B-
Lymphozyten beteiligt ist. CD20 findet sich nur auf neoplastischen und normalen B-
Lymphozyten, nicht auf anderen Leukozyten oder Geweben. Plasmazellen sind ganz
überwiegend negativ für CD20. Immunhistochemisch findet sich eine zytoplasmatische
Färbung. Der Antikörper wird in der Routinediagnostik weit verbreitet eingesetzt und
entsprechend erfahren sind Labor und Pathologen mit diesem Antikörper (Dabbs 2008).
3.5.9 CD23
CD23 ist ein Glykoprotein, welches eine Rolle in der Aktivierung und Wachstum von B-
Lymphozyten spielt. Es handelt sich um ein FC-Fragment eines IgE-Rezeptors. In der
histologischen Diagnostik differenziert eine aberrante CD23-Expression die chronisch-
lymphatische Leukämie (CLL) von z.B. nodalen Mantelzelllymphomen oder Mucosa-
assoziierten Lymphomen (MALT). Weiterhin wird physiologisch das follikuläre dendritische
Netzwerk in der hellen Zone der Keimzentren von lymphatischem Gewebe markiert. Die
Zersiedelung des genuinen Musters ist ein Merkmal von Lymphomen (Schlette et al., 2003).
- 24 -
Der verwendete Antikörper ist ein IgG-Antikörper aus Kaninchen gegen rekombinates CD23
48-248aa (Herstellerangabe). Die Reaktivität ist herstellerseitig für humane Antigene getestet.
Als Kontrollgewebe dient eine Gaumentonsille. Erwartet wird ein für Keimzentrumsfollikel
bzw. follikuläre dendritische Netzwerke typisches Muster einer membranösen Färbereaktion.
3.6 Mikroskopische Auswertung
Das Tumorgewebe wurde an einem Durchlichtmikroskop Typ Axioskop, Fa. Zeiss,
Göttingen, mikroskopisch untersucht. Eine relevante Größe war die Fläche eines
Gesichtsfeldes bei größter Vergrößerung (gebräuchliche englische Abkürzung HPF = high
power field). Diese berechnete sich wie folgt:
- Fläche des Gesichtsfeldes = π x (Sehfelddurchmesser x 0,5)2
- Gesichtsfelddurchmesser = Sehfeldzahl Objektivvergrößerung
Für die 40fache Objektivvergrößerung eines HPF ergab sich mit o.g. Formel ein
Gesichtsfelddurchmesser von 0,55mm.
Mikroskopisch setzten sich die Tumore einerseits aus den Karzinomzellen in verschieden
Differenzierungen und Zellformationen und andererseits aus desmoplastischem Stroma,
Blutkapillaren und einer reaktivem oder präexistenten, leukozytären Zellpopulation
zusammen. Dabei musste zunächst mittels HE-Färbung das Epithel nach Residuen regelhaften
Plattenepithels, z.B. der Krypten oder der auskleidenden Schleimhaut, und nach sicher
invasivem Karzinom und Carcinoma-in-situ unterschieden werden. Vereinzelt galt es,
Ansammlungen epitheloider Histiozyten oder Endothelzellen von dissozierenden
Tumorformationen abzugrenzen. In einigen Proben fand sich in den für die
immunhistochemischen Untersuchungen angefertigten Schnittstufen zunehmend weniger
Tumorgewebe, so dass die Frage der Auswertbarkeit einer Probe im Hinblick auf das zu
untersuchende Merkmal (peritumoral vs. intratumoral) und auf die Prävalenz der zu
untersuchende Zellpopulation am Beginn einer jeden Einzelauswertung stand.
Zur Auswertung der Bildbefunde, d.h. morphologischen Verteilungsmuster, wurden nach
Sichtung der Literatur und in Anlehnung an die in der Routinediagnostik gebräuchliche
Intensitätsbeschreibung entzündlicher Infiltrate wurden folgende Merkmale festgelegt:
- Ort der Infiltration: intratumoral versus peritumoral
- Infiltrationsdichte: reichlich versus schütter versus negativ
- Als reichlich galten mehr als 20 Zellen pro HPF (Durchmesser 0,55 mm).
- 25 -
- Als peritumoral schütter galten weniger als 20 Zellen pro HPF und mehr als 20 Zellen pro
Probe (Durchmesser 2 mm).
- Als intratumoral schütter galten weniger 20 Zellen pro HPF und mehr als 10 Zellen pro
Probe (Durchmesser 2 mm).
- Als negativ galten alle Werte kleiner als 10 bzw. 20 Zellen pro Tumorprobe.
Bei plumper Invasionsfront war die intratumorale Infiltrationsdichte leicht beurteilbar. Bei
diffuser Ausbreitung der Karzinomverbände gab es Leukozyten, die nicht sicher einer
intratumoralen Infiltration zugeordnet werden konnten und deshalb als „tumornah“
klassifiziert wurden.
3.6.1 Auswertung der T-Lymphozyten und Makrophagen
Der Befund der Infiltrationsdichte wurde nach o.g. dreitstufigen Schema graduiert. Die Grade
wurden zwecks statistischer Auswertung nummerisch angegeben. Entsprechend der
Teilergebnisse, dass nur wenige Karzinome keine Infiltration durch T-Lymphozyten und
Makrophagen aufwiesen und die überwiegende Zahl der untersuchten Karzinome eine
schüttere oder dichte Infiltration aufwiesen, erfolgte unter Inkaufnahme einer starken
Vereinfachung die Definition der Merkmale „dichte Infiltration“ und „geringgradige
Infiltration“, wobei unter „geringgradig“ die Fälle mit schütterer, tumornaher bis negativer
Infiltration zusammengefasst wurden. Mit dieser zweistufigen Graduierung erfolgte
anschließend der Vergleich zwischen HPV-positiven und HPV-negativen Karzinomen mittels
Vierfeldertest.
3.6.2 Auswertung B-Lymphozyten und Plasmazellen
Auch für B-Lymphozyten und Plasmazellen erfolgte zunächst die oben beschriebene
dreistufige Evaluation aller Fälle unabhängig von weiteren Parametern. Da die Karzinome
zumeist eine schüttere oder tumornahe bis fehlende Infiltration durch B-Lymphozyten und
Plasmazellen aufwiesen und eine dichte Infiltration kaum vorkam, wurden die Fälle mit
weniger als 20 Zellen pro Probe als „negativ“ subsumiert und Fälle mit mehr als 20 Zellen pro
Probe (schütter und tumornah sowie dicht) als „positiv“ subsumiert.
score 0 negativ (<20 Zellen / Probe ) 1 tumornah (nur für intratumoral) 2 schütter 3 dichte Infiltration (> 20 / HPF)
Tabelle 2: Auswertungs-score
- 26 -
3.6.3 Auswertung follikuläre Keimzentrumsreste
Der Nachweis dentritischer Netzwerke follikulärer Keimzentren konnte mit „vorhanden“ oder
„nicht vorhanden“ beurteilt werden. Bei der Auswertung von je zwei Proben pro Patient mit
unterschiedlichem Ergebnis, wurde das Merkmal „vorhanden“ als dominant eingestuft.
3.7 Statistik
Die Rohdaten wurden in Datensätzen mit Microsoft Excel dokumentiert und ausgewertet.
Mittels Chi-Quadrat-Vierfelder-Test wurde geprüft, ob die Merkmale stochastisch unabhängig
sind, und die Wahrscheinlichkeit der Nullhypothese als p-Wert angegeben. Bei p-Werten von
weniger als 0,05 wird der Unterschied als signifikant definiert. Bei p-Werten von weniger als
0,005 als hochsignifikant definiert.
Auf Grund des stark explorativen Charakters der Studie wurde auf eine Adjustierung für
multiples Testen nach Bonferroni verzichtet (Bland und Altmann, 1995).
4 Ergebnisse
4.1 HPV-Status
Insgesamt zeigten 54 von 247 Karzinomen (22%) Zeichen einer onkogenen Transformation
durch HPV, d.h. der HPV-Status wurde hier als positiv klassifiziert. Davon war in der Hälfte
der Fälle (11%) mittels in-situ-Hybridisierung auch virale Nukleinsäure eines high-risk-
Subtyps 16, 18, 31, 33 oder 51 eindeutig nachweisbar. In den invasiven Karzinomzellen
fanden sich vorwiegend feine, mitunter einzelne punktförmige Gensignale, welche für eine
Integration des Virusgenoms in das Zellgenom sprechen. In vielen Fällen waren mehr als
zwei kleine, einzeln liegende Signale zu beobachten, die mit einer Amplifikation viraler
DNA-Abschnitte vereinbar sind. Zytoplasmatische oder haufenförmige Gensignale als
Zeichen episomaler Virus-DNA traten nicht auf. Als negativ wurden Fälle gewertet, die eine
gänzlich negative Reaktion aufwiesen oder eine auch extrazelluläre, diffuse Färbung. Letztere
galt allgemein als Färbeartefakt, zum Beispiel durch unzureichende Waschschritte. Diese
konnte mittels negativem PCR-Befund bestätigt werden. Die Fälle mit high-risk-HPV-DNA-
Nachweis wiesen ein für eine onkogene Transformation typisches immunhistochemisches
Expressionsmuster von p16ink4 auf. Fälle eines positiven high-risk-HPV-Nachweises ohne p16
Expression fanden sich nicht. In 176 Fällen (72%) wurde der HPV-Status als negativ zu
klassifiziert. Es traten keine Karzinome mit p16-Überexpression und alleinigem genomischen
- 27 -
Nachweis von low-risk-HPV der Subtypen 6 oder 11 auf. Eine Ko-Infektion von low-risk-
HPV und high-risk-HPV fand sich nicht. 12 Fälle (5%) waren nicht auswertbar, da in der
Multiblockprobe kein Karzinom, sondern nur peritumorales Stroma erfasst war oder die
Schnittpräparate beider Proben abgeschwommen waren. Unter den auswertbaren Fällen
betrug die Prävalenz HPV-induzierter Karzinome des Kopf-Hals-Bereiches 23%.
positiv mit ISH positiv ohne ISH negativ n.a. N % N % N % N % HPV Status 28 11% 26 11% 176 72% 12 5%
Tabelle 3
4.2 T-Lymphozyten (CD3)
Abbildung 12 a-c von rechts nach links: a) CD3 negativ, b) peritumoral reichlich c) peritumoral schüttere Infiltration. Orginalvergrößerung jeweils 100x. Maßstabsbalken 200µm, Kreisdurchmesser ein HPF
Mittels immunhistochemischer Untersuchung mit einem Antikörper gegen CD3 wiesen
nahezu alle Proben eine Infiltration durch T-Lymphozyten auf. Lediglich in 2 Fällen (1%)
wurde eine Lymphozyteninfiltration von weniger als 20 T-Lymphozyten pro 2-mm-Probe
beobachtet. Gemäß Definition im Methodenteil wurde dieser Befund als negativ klassifiziert.
Bei 106 Fällen (43%) wiesen die Proben eine dichte peritumorale Infiltration durch T-
Lymphozyten auf. 116 Fälle (47%) zeigten eine schüttere peritumorale Infiltration durch T-
Lymphozyten. In Proben aus 21 Fällen (9%) war die T-Lymphozyteninfiltration trotz
Doppelbestimmung nicht auswertbar.
Hingegen betrug die Häufigkeit einer dichten intratumoralen T-Lymphozyteninfiltration 31%
der Fälle und die Häufigkeit einer tumornahen oder schütteren T-Lymphozyteninfiltration
55%. Die Häufigkeit eines definitionsgemäß negativen Befundes (weniger als 20 T-
Lymphozyten in der Tumorprobe) betrug lediglich 4%.
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dicht schütter negativ n.a. Anzahl Anzahl Anzahl Anzahl CD3 peritumoral 106 43% 116 47% 2 1% 21 9% CD3 intratumoral 76 31% 134 55% 10 4% 25 10% n=245
Tabelle 4: Verteilung Lymphozyteninfiltration (CD3)
Der Vergleich der HPV-positiven Karzinome mit den HPV-negativen Karzinomen ergab eine
unterschiedliche Verteilung der Lymphozyteninfiltrate: 73% der HPV-positiven Karzinome
wiesen eine dichte peritumorale Infiltration durch T-Lymphozyten auf. Bei 27% der HPV-
positiven Karzinome trat eine geringe (negativ bis schütter) peritumorale Infiltration von T-
Lymphozyten auf. Hingegen zeigten bei den HPV-negativen Karzinomen 56% der Proben
eine geringe (negativ bis schütter) peritumorale Infiltration. Dieser Unterschied ist mit einem
p-Wert von 0,024 statistisch zumindest signifikant.
Ein ähnlicher, statistisch hochsignifikanter Unterschied zwischen HPV-positiven und HPV-
negativen Karzinomen fand sich bei Betrachtung der intratumoralen T-
Lymphozyteninfiltration: Hier wies die Mehrzahl (72%) der HPV-positiven Karzinome eine
dichte T-Lymphozyteninfiltration auf, während weniger als ein Drittel (28%) nur durch
wenige bis keine T-Lymphoyzten infiltriert wurde. Hingegen wurde die Mehrzahl (70%) der
HPV-negativen Karzinome nicht oder nur wenig (schütter) durch T-Lymphozyten infiltriert
und nur weniger als ein Drittel (30%) wies eine dichte intratumorale T-
Lymphozyteninfiltration auf. Dieser Unterschied war mit einem p-Wert von < 0,001
statistisch hoch signifikant.
CD3 peritumoral HPV + HPV - gering 27% 56% dicht 73% 44% p = 0,024
Tabelle 5: Verteilung peritumorale Lymphozyteninfiltration in Abhängigkeit des HPV-Status
CD3 intratumoral HPV + HPV - gering 28% 70% dicht 72% 30% p = < 0,001
Tabelle 6: Verteilung intratumorale Lymphozyteninfiltration in Abhängigkeit des HPV-Status
- 29 -
4.3 T-Helferzellen (CD4)
Abbildung 13 a-c von rechts nach links: a) CD4 peritumoral schütter, b) peritumoral reichlich c) intratumoral schütter / tumornah. Orginalvergrößerung jeweils 100x. Maßstab wie in Abb. 4-1.
Während wie oben beschrieben kaum ein Karzinom ohne begleitende oder intratumorale T-
Lymphozyten (CD3) zu finden war, konnte in einem knappen Viertel (22%) der Karzinome
keine intratumorale Infiltration durch T-Helferzellen (CD4) beobachet werden. In einem
anderen Viertel der Fälle (27% bzw. 24%) fand sich eine intratumoral bzw. peritumoral dichte
Infiltration durch T-Helferzellen.
dicht schütter negativ n.a. Anzahl Anzahl Anzahl Anzahl CD4 peritumoral 65 27% 137 56% 23 9% 20 8% CD4 intratumoral 59 24% 105 43% 54 22% 27 11% n=245
Tabelle 7: Verteilung T-Helferzellen (CD4)
57% der HPV-positiven Karzinome wiesen eine intratumoral dichte Infiltration durch T-
Helferzellen auf. Im Vergleich dazu fand sich dieses Phänomen nur bei 24% der HPV-
negativen Karzinome. Bzw. 76% der HPV-negativen Karzinome wiesen keine oder nur einen
geringen T-Helferzell-Gehalt auf. Dies war mit einem p-Wert von 0,03 noch signifikant. Für
das peritumorale Gewebe hingegen trat ein signifikanter Unterschied der T-Helferzell-
Infiltration nicht auf.
HPV + HPV - gering 62% 72% dicht 38% 28% p = 0,8 Tabelle 8: Verteilung peritumorale T-Helferzellen (CD4) in Abhängigkeit des HPV-Status
HPV + HPV - gering 43% 76% dicht 57% 24% p = 0,03 Tabelle 9: Verteilung intratumoraler T-Helferzellen in Abhängigkeit des HPV-Status
- 30 -
4.4 zytotoxische T-Lymphozyten (CD8)
Abbildung 14 a-c von rechts nach links: a) peritumoral reichlich und intratumoral schütter DD tumornahe CD8-positive Lymphozyten b) peritumoral schüttere und intratumoral negative Infiltration c) peri- und intratumoral dichte Infiltration
Für die Subgruppe der CD8-expremierenden, überwiegend zytotoxischen T-Lymphozyten
ergab sich ein ähnliches Verteilungsmuster wie bei den T-Helferzellen. Jeweils ein Viertel der
Fälle wies peritumoral und intratumoral eine dichte Infiltration durch CD8-expremierende T-
Lymphozyten auf. Die übrigen Fälle wiesen eine schüttere bis fehlende Infiltration durch
CD8-positive T-Lymphozyten auf. In 6% bzw. 8% der Fälle waren die Proben aus dem
Multigewebeblock im Zuge der Untersuchung abgeschwommen oder kein invasives
Karzinom erfasst.
dicht schütter negativ n.a. Anzahl Anzahl Anzahl Anzahl CD8 peritumoral 53 22% 164 67% 13 5% 15 6% CD8 intratumoral 63 26% 117 48% 45 18% 20 8% n=245
Tabelle 10: Verteilung CD8-expremierender T-Lymphozyten
63% bzw. 68% der HPV-positiven Karzinome wiesen eine dichte intratumorale und
peritumorale Infiltration durch CD8-positive T-Lymphozyten auf, während HPV-negative
Karzinome überwiegend (81% bzw. 77%) nicht oder nur gering von diesen zytotoxischen T-
Lymphozyten infiltriert wurden. Dieser Unterschied war für beide Merkmale (intratumoral
und peritumoral) signifikant. Weiterhin korrelierte für zytotoxische T-Lymphozyten die
Häufigkeit peritumoraler Infiltration mit der intratumoralen Infiltration. Für andere Zellarten
war dies nicht der Fall.
HPV + HPV - gering 37% 81% dicht 63% 19% p < 0,001 Tabelle 11: peritumorale zytotoxische T-Lymphozyten (CD8) in Abhängigkeit des HPV-Status
- 31 -
HPV + HPV - gering 31% 77% dicht 68% 23% p < 0,001 Tabelle 12: intratumoraler zytotoxische T-Lymphozyten (CD8) in Abhängigkeit des HPV-Status
4.5 TIA
Abbildung 15 a-c von rechts nach links: a) peritumoral schüttere und intratumoral schütter DD tumornahe TIA-positive Lymphozyten b) peritumoral schüttere und intratumoral negative Infiltration c) peritumoral dichte und intratumoral negative Infiltration
Zytotoxische bzw. NK-T-Lymphozyten gehörten zum peritumoralen Milieu von 96% der
auswertbaren Karzinome. In der überwiegenden Zahl der Fälle (73%) war die peritumorale
Infiltrationsdichte als gering einzustufen. Im intratumoralen Kompartiment traten TIA-
exprimierende, aktivierte zytotoxische T-Lymphozyten in überwiegend geringer Dichte (48%)
oder gar nicht (20%) auf. Hingegen fiel ein Fünftel der Fälle (22%) durch eine intratumoral
dichte Infiltration der TIA-positiven Lymphozyten auf.
dicht schütter negativ n.a. Anzahl Anzahl Anzahl Anzahl TIA peritumoral 39 16% 179 73% 10 4% 17 7% TIA intratumoral 55 22% 118 48% 50 20% 22 9% n=245
Tabelle 13: Verteilung TIA-expremierender T-Lymphozyten
Das Merkmal der dichten peritumoralen Infiltration durch TIA-expremierende Lymphozyten
war bei HPV-negativen und HPV-positiven Karzinomen gleich verteilt. Hingegen war das
Merkmal einer dichten intratumoralen Infiltration in der Gruppe der HPV-positiven
Karzinome mit 58% gegenüber 21% signifikant häufiger zu beobachten als in HPV-negativen
Karzinomen.
HPV + HPV - gering 78% 83% dicht 22% 17% p = 0,94 Tabelle 14: peritumorale aktivierte T-Lymphozyten (TIA) in Abhängigkeit des HPV-Status
- 32 -
HPV + HPV - gering 42% 79% dicht 58% 21% p = 0,004 Tabelle 15: intratumorale aktivierte T-Lymphozyten (TIA) in Abhängigkeit des HPV-Status
4.6 PD-1
Abbildung 16 a-c: a) dichte Infiltration durch PD1-positive T-Lymphozyten b) schüttere Infiltration c) negative Lymphozyten und positive Tumorzellkerne. Originalvergrößerung 100x
Ein Anteil von 27% bzw. 16% der Karzinome wies eine dichte intra- und peritumorale
Infiltration durch aktivierte, PD-1-expremierende Lymphozyten auf. Nur 4% der Fälle waren
ohne peritumorale Infiltration. Zum Vergleich: Nur 1% der hier untersuchten Fälle wiesen
keine peritumorale T-Zellinfiltration (CD3) und nur 5% keine zytotoxischen T-Lymphozyten
(CD8) auf. Intratumoral hingegen waren Fälle mit PD-1-negativen T-Lymphozyten
anzunehmen, da bei 29% Karzinomen keine PD-1-Expression vorlag, aber lediglich 4% der
Karzinomen keine intratumorale T-Zellinfiltration (CD3) aufwiesen. Hieraus ergab sich der
Verdacht, dass PD-1 intratumoral eine wichtigere Rolle spielte als peritumoral. Andererseits
gibt es auch eine Lücke von jeweils 16-Prozentpunkten zwischen der dichten Pan-T-
Zellinfiltration (CD3) von 43% bzw. 31% peritumoral bzw. intratumoral und der Fraktion der
aktivierten, PD-1-expremierenden Lymphozyten (27% bzw. 16%).
Tabelle 16: Verteilung PD-1-expremierender Lymphozyten
Die Infiltrationsdichte durch PD-1-expremierende Lymphozyten war sowohl für das
intratumorale Kompartiment als auch für das peritumorale Kompartiment unabhängig vom
HPV-Status überwiegend gering.
HPV + HPV - gering 85% 71% dicht 15% 29% p = 0,35 Tabelle 17: peritumorale, PD-1-expremierende Lymphozyten in Abhängigkeit des HPV-Status
dicht schütter negativ n.a. Anzahl Anzahl Anzahl Anzahl PD1 peritumoral 65 27% 154 63% 11 4% 15 6% PD1 intratumoral 39 16% 114 47% 72 29% 20 8% n=245
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HPV + HPV - gering 77% 84% dicht 23% 16% p = 0,88 Tabelle 18: intratumorale, PD-1-expremierende Lymphozyten in Abhängigkeit des HPV-Status
4.7 B-Lymphozyten (CD20)
Abbildung 17 a-c von links nach rechts: a) fehlende B-Lymphozyteninfiltration b) peritumoral dichte und intratumoral negative B-Lymphozyteninfiltration c) peritumoral reichliche und intratumoral schüttere Infiltration. Orginalvergrößerung 100x
Das peritumorale Stroma und die Karzinome wurden überwiegend von T-Lymphozyten
infiltriert. Nur in einem kleinen Teil der Fälle (13% bzw. 4%) fand sich eine dichte B-
Lymphozyteninfiltration des peritumoralem Stromas und Tumors. Die überwiegende Zahl der
Fälle war nur schütter oder gar nicht von B-Lymphozyten infiltriert.
dicht schütter negativ n.a. Anzahl Anzahl Anzahl Anzahl CD20 peritumoral 31 13% 103 42% 98 40% 13 5% CD20 intratumoral 9 4% 54 22% 167 68% 15 6% n=245
Tabelle 19: Verteilung der B-Lymphozyten
HPV-positive Karzinome zeigten etwas häufiger (33%) eine histomorphologisch relevante,
peritumorale B-Lymphozyteninfiltration als HPV-negative Karzinome (11%). Der
Unterschied war mit einem p-Wert von < 0,1 statistisch lediglich als Trend einzuordenen.
Hingegen wiesen HPV-positive Karzinome die überwiegend schüttere intratumorale B-
Lymphozyteninfiltration mit 22% genauso selten auf wie HPV-negative Karzinome (24%).
HPV + HPV - negativ 67% 89% positiv 33% 11% p = 0,093 Tabelle 20: peritumorale, B-Lymphozyten in Abhängigkeit des HPV-Status
HPV + HPV - negativ 78% 76% positiv 22% 24% p = 0,99 Tabelle 21: intratumorale, B- Lymphozyten in Abhängigkeit des HPV-Status
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4.8 Keimzentrumsfollikel (CD23)
Dendritische Netzwerke als Zeichen lymphofollikulärer Keimzentren im peritumoralen
Stroma ließen sich in nur 11% der Fälle nachweisen. Ob es sich um residuelle Lymphfollikel
des lymphatischen Gewebes des Waldeyerschen Rachenringes oder neue, reaktive, durch das
Karzinom induzierte Lymphfollikel handelt, war an den TMA-Proben nicht zu unterscheiden.
Abbildung 18: residueller Lymphfollikel (CD23). Orginalvergrößerung 100x
vorhanden nicht vorhanden n.a.
Anzahl Anzahl Anzahl Keimzentrumsfollikel 27 11% 205 84% 13 5% n=245
Tabelle 22: Nachweis residueller Keimzentren
HPV-positive Karzinome wurden in 26% der Fälle und damit doppelt so häufig von
peritumoralen lymphofollikulären Keimzentren begleitet wie HPV-negative Karzinome. Bei
beiden Karzinomentitäten waren umgebende Keimzentren in der Mehrheit der Fälle nicht
nachweisbar (90% und 74%). Es gab damit keinen signifikanten Unterschied bezüglich der
CD23-Expression zwischen HPV-positiven und HPV-negativen Karzinomen.
HPV+ HPV- Keimzentrumsfollikel CD23 negativ 74% 90% Keimzentrumsfollikel CD23 positiv 26% 10% p = 0,3 Tabelle 23: Keimzentren in Abhängigkeit des HPV-Status
4.9 Plasmazellen (CD38)
Abbildung 19 a bis c von links nach rechts: a) fehlende Plasmazellen b) dichte peritumorale Infiltration c) schütter peritumorale Infiltration. Orginalvergrößerung 100x
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Wie bei B-Lymphozyten waren auch Plasmazellinfiltrate überwiegend schütter oder negativ.
Peritumoral fanden sich lediglich in 14% der Fälle dichte peritumorale Plasmazellinfiltrate.
Nur in einem Fall fand sich eine dichte intratumorale Plasmazellinfiltration.
dicht schütter / tumornah negativ n.a. Anzahl Anzahl Anzahl Anzahl CD38 peritumoral 34 14% 127 52% 66 27% 18 7% CD38 intratumoral 1 0% 76 31% 147 60% 21 9% n=245
Tabelle 24: Verteilung der Plasmazellen
Gemäß Definition der Methode wurde auf Grund der überwiegend schütteren und fehlenden
Plasmazellinfiltration eine Klassifizierung in positiv (mehr als 20 Plasmazellen pro Probe)
und negativ (weniger als 20 Plasmazellen pro Probe) durchgeführt. Es zeigte sich ein
statistischer Trend, dass HPV-positive HNPCC häufiger eine positive Plasmazellinfiltration
aufwiesen als HPV-negative HNPCC. Für die Infiltrationsdichte des intratumoralen
Kompartimentes ergab sich zwischen HPV-negativen und HPV-positiven Karzinomen kein
Unterschied.
HPV + HPV - negativ 63% 88% positiv 37% 12% p = 0,074 Tabelle 25: peritumorale Plasmazellen in Abhängigkeit des HPV-Status
HPV + HPV - negativ 56% 67% positiv 44% 33% p = 0,76 Tabelle 26: intratumorale Plasmazellen in Abhängigkeit des HPV-Status
4.10 Makrophagen (CD68)
Abbildung 20 a bis c von links nach rechts: a) peritumoral schüttere, intratumoral negative Makrophagen b) peritumoral reichlich und intratumoral schütter c) peritumorale schüttere und intratumoral dichte Makrophageninfiltration. Orginalvergrößerung 100x
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Makrophagen wurden in nahezu allen Karzinomen und deren peritumoralen Stroma
nachgewiesen. Nur in wenigen Fällen (1% bzw. 6%) fanden sich kaum tumorassozierte
Makrophagen.
dicht schütter / tumornah negativ n.a. Anzahl Anzahl Anzahl Anzahl PGM1 peritumoral 95 39% 130 53% 2 1% 18 7% PGM1 intratumoral 98 40% 113 46% 15 6% 19 8% n=245
Tabelle 27: Verteilung der Makrophageninfiltrate
Nach Darstellung mit einem Antikörper gegen CD68 wiesen die HPV-positiven Karzinome
häufiger eine dichte intratumorale Makrophageninfiltration auf als HPV-negative Karzinome
(77% vs. 40%). Dieser Unterschied war mit einem p-Wert von kleiner als 0,001 hoch
signifikant. Die peritumorale Verteilung ist hingegen bei HPV-positiven Karzinomen und bei
HPV-negativen Karzinomen gleich. Die gleiche peritumorale Verteilung unterstrich die für
HPV-positive HNPCC besondere Rolle intratumoraler Makrophagen und konnte als Effekt
der Immunantwort auf diese Tumorentität angesehen werden. Ein Artefakt durch praexistente
Histiozyten z.B. auf Grund der Prädisposition der HPV-positiven Karzinome im
Waldeyerschen Rachenring erschien damit unwahrscheinlich.
HPV + HPV - gering 58% 58% dicht 42% 42% p = 0,99 Tabelle 28: peritumorale Makrophagen in Abhängigkeit des HPV-Status
HPV + HPV - gering 23% 60% dicht 77% 40% p < 0,001 Tabelle 29: intratumorale Makrophagen in Abhängigkeit des HPV-Status
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5 Diskussion
5.1 HPV-Nachweis im Wandel der Zeit
In dem Zusammenhang zwischen lokaler Immunreaktivität und Karzinogese an 20 Patienten
mit reaktiven und prämalignen Schleimhautveränderungen wurde bereits 1986 auch ein
Zusammenhang mit humanen Papillomaviren diskutiert. In 7 von 10 Karzinompatienten und 6
von 10 Leukoplakiepatienten wurde ein HPV-Kapsid-Antigen gefunden (Lind et al., 1986).
Seitdem mussten wir dazulernen, dass die bloße Anwesenheit von humanen Papillomaviren
nicht mit der Karzinogese gleichzusetzen ist. Die Prävalenz einer HPV-Infektion kann in
Abhängigkeit von Lokalisation im Kopf-Hals-Bereich und Kulturkreis der Patienten bei den
o.g. 60 bis 70% liegen. Hingegen ist die HPV-induzierte, onkogene Transformation im Kopf-
Hals-Bereich lokalisationsabhängig deutlich seltener als eine reine HPV-Infektion (Quabius et
al., 2014). Ein Schlüssel zum Verständnis der distinkten Entität sogenannter HPV-positiver
Karzinome des Kopf-Hals-Bereiches ist es, die Gruppe der mit HPV assoziierten Karzinome
durch die Wahl der Untersuchungsmethoden auf diejenige zu reduzieren, bei denen Zeichen
einer onkogenen Transformation der Wirtszellen durch HPV vorliegen und nicht nur eine
Infektion der Schleimhaut oder serologische Immunität z.B. auf Grund von Impfung oder
genitaler Infektion. Bei der Schleimhautinfektion findet sich episomale Virus-DNA, die wie
bei allen DNA-Viren repliziert wird und zur Bildung eines Kapsidproteins dient und in einer
Ausschüttung neuer Viren an der Epitheloberfläche mündet. Diese replikative oder produktive
Phase der Infektion wird ebenso wie geringgradige Dysplasie als reversibel angesehen. Ein
kleiner Teil der Menschen ist von einer persistierenden Infektion betroffen und ein noch
kleinerer Teil davon kann von einer onkogenen Transformation des Epithels betroffen sein.
Nicht der alleinige Nachweis von DNA der HP-Viren irgendwo in der Schleimhaut der Kopf-
Hals-Region ist Charakteristikum eines durch HPV induzierten Karzinoms, sondern die
Lokalisation der DNA in den neoplastischen Zellkernen und die onkogene Aktivität der Gene
E6 / E7 des humanen Papillomavirus, welche durch eine immunhistochemische Untersuchung
mit p16 dargestellt werden kann. Der Nachweis von HPV-DNA mittels PCR ist nicht
lokalisationsspezifisch und somit nicht zur Unterscheidung einer Infektion von einer
onkogenen Transformation geeignet. Damit ist eine PCR aus Proben der
Oberflächenschleimhaut, oberflächlichen Tumoranteilen oder Abstrichen allein nicht zur
Bestimmung des HPV-Status geeignet. Der Nachweis von HPV-DNA mittels in-situ-
Hybridisierung ist zwar weniger sensitiv, aber mit etwas Erfahrung des Untersuchers sehr
spezifisch. Ang und Mitarbeiter berichten eine höhere Nachweisrate von HPV-DNA mittels
- 38 -
in-situ-Hybridisierung als in dieser Studie. Deren Hybridisierungs-Sonden des Herstellers
Dako umfassen mehr HPV-Subtypen und könnten sensitiver sein. Ferner fokussiert deren
Studie mehr auf die Subgruppe der oropharyngealen Karzinome. Schließlich kann die
unterschiedliche oropharyngeale HPV-Infektionsrate durch unterschiedliche soziokulturelle
Faktoren jenseits des Atlantiks geprägt sein. In Anlehnung an die Methode von Ang und
Mitarbeitern, die sowohl für positive DNA-in-situ-Hybridisierung als auch positive p16-
Immunhistochemie den gleichen positiven Effekt für das Gesamtüberleben aufzeigen, wird
auch in der vorliegenden Arbeit bei passender Morphologie auch die Expression von p16ink4
als Surrogatmarker für eine onkogene Aktivität durch HPV akzeptiert. Dies wird durch eine
statistische Studie zu Prognosefaktoren unserer Arbeitsgruppe für diese Studienpopulation
unterstützt. Darin zeigen wir, dass diese Definition der HPV-Positivität mit prominenteren
Unterschieden im Vergleich zu HPV-negativen HNSCC einhergehen (Rades et al., 2013).
Damit passt die in dieser retrospektiven Studienpopulation aus der Klinik für Strahlentherapie
beobachtete Prävalenz HPV-positiver Karzinome von 22% in den Kontext aus der genannten
Literatur und aus einem weiteren eigenen Patientenkollektiv aus der Mund-Kiefer-
Gesichtschirurgie. Dort findet sich eine Prävalenz von 7% in der Mundhöhle und 26% im
Rachen inklusive Zungengrund (Hofmann, 2014). Fälle einer fehlenden p16-Expression trotz
eines positiven genomischen Nachweises von high-risk-HPV-DNA in den Zellkernen der
Karzinomzellen mittels in-situ-Hybridisierung fanden sich nicht. Dies belegt die hohe
Sensitivität der p16-Expression als Surrogatmarker für einen positiven HPV-Status. Unter der
Voraussetzung, dass eine durchgehende, nukleäre und zytoplasmatische Expression in
proliferierenden Plattenepithelkarzinomzellen der Schleimhaut des Kopf-Hals-Bereiches
vorliegt, ist die Reaktion auch als spezifisch einzustufen. Hierfür spricht die mit der Zeit
zunehmende Möglichkeit, mit sensitiveren Methoden wie zum Beispiel der RNA-ISH oder
mittels Sequenzierung oder mittels PCR in DNA-ISH negativen und p16-positven HNSCC
noch Nucleinsäuresequenzen der Papillomaviren nachzuweisen (Ukpo et al., 2011).
Anderslautende Studien (unter anderem die von Klingenberg et al., 2010) haben diesbezüglich
weniger strenge Kriterien für die positive Expression angewandt. So darf z.B. die
oberflächliche positive Reaktion degenerativ veränderter, nicht-proliferationsaktiver
Plattenepithelien (sogenanntes patchy-pattern) oder von Nicht-Plattenepithelkarzinomen (z.B.
seröse Ovarialkarzinome) nicht als Hinweis für eine HPV-Induktion angesehen werden.
- 39 -
5.2 Unterschiede im Tumormikromilieu HPV-positiver und HPV-
negativer Plattenepithelkarzinome
Die geringe Zahl peritumoral nachweisbarer lymphofollikulärer Keimzentren ist
bemerkenswert, da diese im lymphoepithelialen Gewebe des Kopf-Hals-Bereiches
insbesondere im Zungengrund, Oro- und Hypopharynx reichlich vorkommen (vgl. Abbildung
2). Ebenso wäre eine Korrelation mit HPV-positiven Karzinomen schon deshalb zu erwarten
gewesen, weil diese bevorzugt in den Krypten des Waldeyerschen Rachenringes (Oropharynx
und Zungengrund) lokalisiert sind. Dieses Verteilungsmuster spricht gegen einen Effekt des
präexisten lymphatischen Gewebes auf die beobachtete, signifikant vermehrte T-
Lymphozyteninfiltration HPV-positiver Karzinome gegenüber HPV-negativen Karzinomen.
In HPV-positiven Plattenepithelkarzinomen finden sich signifikant häufiger dichte
peritumorale und intratumorale T-Lymphozyteninfiltrate (CD3+) als in HPV-negativen
Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches. Kong et al beschreiben eine bessere
Prognose HPV-assoziierter HNSCC und eine Korrelation des HPV-Status mit intratumoralen
CD3-positven T-Lymphozyteninfiltraten. Allerdings nutzen Kong et al zum HPV-Nachweis
die Methode der Pyrosequenzierung, die im Vergleich zur in-situ-Hybridisierung eine
Lokalisation des HPV-Gens nicht ermöglicht (Kong et al., 2009).
Bereits Badoul zeigte in 2006, dass der Nachweis tumorinfiltrierender, aktivierter, CD4-
positiver T-Lymphozyten mit einer besseren lokoregionären Kontrolle einhergehe (Badoual et
al., 2006). Eines der obigen Ergebnisse ist auch eine vermehrte Häufigkeit CD4-positiver T-
Lymphozyten zugunsten der HPV-positiven Karzinome unter den HNSCC, wenngleich auch
nach statistischer Kontrolle nicht hochsignifikant sondern als Trend. Insofern gilt es in
weiterer Aufarbeitung der Daten herauszufinden, ob die prognostisch günstigen CD4-
infiltrierten HNSCC auch die HPV-induzierten Karzinome sind, da wir in einer weiteren
Arbeit zeigen konnten, dass in multivariater Analyse HPV-positive Karzinome nach Radiatio
eine signifikant bessere lokoregionäre Kontrolle, höheres metastasenfreies Überleben und
Gesamtüberleben aufweisen (Rades et al., 2011).
In dieser Studie sind dichte intratumorale und peritumorale CD8-positive, zytotoxische T-
Lymphozyteninfiltrate sowie TIA-positive Lymphozyten in HPV-positiven Karzinomen
häufiger als in HPV-negativen Karzinomen. Immunologen beobachten im peripheren Blut
von Patienten mit HPV-positiven Karzinomen mehr CD8-positive T-Lymphozyten, die eine
Spezifität gegen Peptidderivate des Onkogen E7 tragen, verglichen mit HPV-negativen
Karzinomen (Albers et al., 2005; Hoffmann et al., 2006). Ob auch dies mit einer günstigeren
Prognose oder einem besseren Therapieansprechen korreliert, sollte Gegenstand weiterer
- 40 -
Studien sein. In diesem Zusammenhang ist zu beachten, dass HP-Viren lange dem
Immunsystem entgehen, was eine persistierende HPV-Infektion begünstigt und dadurch zu
einem erhöhten Risiko der Induktion einer Dysplasie / Neoplasie führt. Hier setzt die
Schutzwirkung der primär gegen das Zervixkarzinom etablierten Impfung junger Frauen an.
Eine Reduktion der HPV-positiven Kopf-Hals-Tumoren könnte damit ebenfalls einhergehen
oder aber eine immunologische Sonderrolle gewinnen. An welcher Stelle im Verlauf der
Tumorprogression das HPV-positive Plattenepithelkarzinom immunologisch erkannt wird, ist
unbekannt.
5.3 PD-1 und therapeutische Perspektive
Entzündungsreaktionen sind zwar teils auch für die initiale Tumorentstehung relevant, aber
hier stehen Noxen und Infektionen sowie genetische und epigenetische Faktoren zumeist am
Anfang der Modellvorstellungen zur Kausalkette. Damit aus einem neoplastischen Klon
mutierter, autonom proliferierender Zellen ein Tumor wird, muss dieser einerseits
Mechanismen aufweisen, um dem Immunsystem zu entkommen. Anderseits kann sich ein
entstehendes Karzinom das Mikromilieu zur weiteren Tumorprogression zunutze machen.
Und drittens kann das Tumomikromilieu etablierte Therapien unterstützen oder direkt
therapeutisch genutzt werden (Hanahan und Weinberg, 2011). So diskutieren Badoual und
Coautoren nicht nur die mit vermehrter T-Helferzell-Infiltration assoziierte besserer Prognose,
sondern auch die mit vermehrter T-Zellinfiltration in vitro einhergehende vermehrte
Tumorprogression, welche möglicherweise durch die oben erwähnte Immuntoleranz
begünstigt wird (Badoual et al., 2010). Trotz des Befundes vermehrter intra- und
peritumoraler Lymphozyten könne eine Toleranz des Immunsystems vorliegen, z.B. über
tumorbedingte Veränderungen an den HLA-Rezeptoren oder verminderte Fähigkeit der CD8-
positiven Zellen zytotoxisch zu wirken. Ein aktuell diskutierter Kandidat ist der auf bis zu
60% von frischen HNSCC expremierte PD1-Ligand, der an PD-1 bindet und für den gezeigt
werden konnte, dass er in vitro Apoptose an aktivierten, tumor-reaktiven T-Lymphozyten
auslöst (Strome et al., 2003; Zhang et al., 2009). Für HPV-positive HNSCC deutet sich
diesbezüglich ein Unterschied zu HPV-negativen Karzinomen an. In ¾ der Karzinome finden
sich unabhängig vom HPV-Status nur wenige bis keine PD-1-expremierenden Lymphozyten.
Dies erscheint reziprok zu den 68% bzw. 63% HPV-positiven HNSCC mit dichter CD8+-
Lymphyzyteninfiltration. Für HPV-negative Karzinome und damit die Mehrheit der HNSCC
mag die These von Strome et al. anwendbar sein, dass HNSCC eine Immuntoleranz
produzieren. Diese ist in HPV-positiven HNSCC weniger zu beobachten. Sie stellen auch
- 41 -
diesbezüglich eine eigene Entität dar, die die Wiederholung älterer Studien an HNSCC unter
dem Aspekt des HPV-Status rechtfertigt. Insbesondere ist eine Expressionsanalyse von PD-
Ligang in Abhängigkeit des HPV-Status angeraten, sobald ein paraffingängiger Antikörper
verfügbar ist.
Der Erfolg von Ipilimumab beim metastasierten Melanom zeigt mögliche therapeutische
Durchbrüche in der Krebstherapie jenseits oder ergänzend zu bisher direkt gegen
proliferierende Karzinomzellen gerichtete zytostatische Chemotherapie und Radiatio.
Ipilimumab ist ein monoklonaler Antikörper gegen das mit zytotoxischen T-Lymphozyten
assozierte Antigen CTLA-4. CTLA-4 ist ebenso wie PD-1 ein regulatorischer Rezeptor auf
aktivierten T-Lymphozyten. Dessen Hemmung führt zu einer Wiederherstellung der T-Zell-
Aktivität und -Proliferation. Nach der Zulassung für Melanome laufen jetzt klinische Studien
der Phase I, II und III für Pankreas-, Magen-, Ovar-, Prostata- und Lungenkarzinome. Wie
einleitend für PD-1-knock-out-Mäuse beschrieben, ist die unerwünschte Wirkung von
Ipilimumab eine Autoimmunreaktion. Für die Selbstregulierung der T-Lymphozyten sind
sogenannte Immun-Checkpoints beschrieben, unter anderem der von CTLA-4. Als Inhibitor
des Immun-Checkpoint der nächsten Generation weisen Substanzen zur Inhibition der PD-
1/PD-L1-Interaktion in klinischer Erprobung positive Resultate bei metastsiertem Melanom
und metastasiertem Nierenzellkarzinom auf (Weber, 2014).
5.4 Proliferationsfördernde Effekte des Tumormikrom ilieus
Daneben diskutieren Badoual et al, dass ein inflammatorisch dominiertes Mikromilieu die
Tumorprogression möglicherweise durch eine Stimulation der Neoangiogenese über VEGF
und Fibroblast growth factor (FGF) stimuliert. Angiogenese ist ein wichtiger Schritt in der
Tumorprogression und solide Tumore benötigen eine Tumorangiogenese, um ohne
Einschränkung der Sauerstoff- und Stoffwechselversorgung mehr als 2 bis 3 Millimeter
Größe zu erreichen. Neben der tumoreigenen Angiogenese durch VEGF und Interleukin-8,
können auch proinflammatorische Zytokine über NF-κB zu einer Expression von VEGF und
Interleukin-8 beitragen. Auf Basis des für diese Arbeit erstellten TMA und der untersuchten
HPV-Status wurde in unserer Arbeitsgruppe gezeigt, dass fehlende VEGF-Expression mit
einer besseren lokoregionären Kontrolle, höherem metastasenfreiem Überleben und
Gesamtüberleben einhergehen (Seibold et al., 2013). Es stellt sich die Frage, ob eine durch
Inflammation bedingte Überexpression von VEGF die bei HPV-positiven Karzinomen im
Vergleich zu HPV-negativen Karzinomen frühere und ausgeprägtere (gemessen an der
Primärtumorgröße) Metastasierung erklärt. Dazu ist kritisch zu prüfen, ob das hier aus einer
- 42 -
EORTC-Studie stammende Patientenkollektiv für diese Fragestellung ausreicht oder weitere
nicht zur Radiatio überwiesene Fälle aus den Kliniken für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und
Mund-Kiefer-Gesichtschirurgie zu rekrutieren sind.
Die Ergebnisse signifikant vermehrter intratumoraler Makrophageninfiltrate und TIA-
positiver, aktivierter zytotoxischer Lymphozyten in HPV-positiven HNSCC legen eine
vermehrte immunologische Reaktion gegen diese Entität im Vergleich zu HPV-negativen
HNSCC nahe. Baldoual zitiert eine Arbeit nach der unter anderem unreife Makrophagen,
dendritische Zellen (welche hier mit CD23 nicht nachweisbar waren) und andere myeloische
Zellen zwar über tumorinduzierte Zytokine wie u.a. VEGF angelockt werden, aber über einen
autokrinen Rückkoplungsmechanismus T-Zellrezeptor und CD8-Moleküle in ihrer Funktion
hemmen. Insbesondere weil die peritumorale Makrophageninfiltration unabhängig vom HPV-
Status ist, scheint es eine Frage des Aktivierungszustandes der Makrophagen unmittelbar
durch die Karzinomzellen zu sein, welche hier in HPV-positiven Karzinomen intratumoral
signifikant vermehrt sind. Ein Beispiel für eine Zytokinexpression von HNSCC-Zellinien
wäre C-reaktives Protein (Frenzel et al., 2007), welche in dem Kontext dieser Arbeit danach
fragen lässt, ob es sich um HPV-positive oder HPV-negative Tumorzelllinien handelt.
5.5 Einfluss der Strahlentherapie
Die nach Radiatio beobachtete bessere Prognose HPV-positiver HNSCC gegenüber HPV-
negativen HNSCC einerseits (u.a. Ang et al., 2010) und der günstige prognostische Wert einer
fehlenden VEGF-Expression für das Ansprechen auf eine Radiatio andererseits (Seibold et al.,
2013) könnte möglicherweise durch eine veränderte tumorinduzierte Entzündungsreaktion
bedingt sein. Ein höherer Hämoglobinwert geht mit einer besseren Prognose einher und
könnte erklärt sein durch eine höhere Strahlensensitivität eines gut oxygenierten
Tumorgewebes (Rades et al., 2011). Der Zusammenhang zwischen VEGF-Expression und
Prognose vor dem Hintergrund tumorproliferationsfördernder und proangiogener Faktoren,
spricht für einen Einfluss des Tumormikromilieus auf die Strahlensensitivität. Inwieweit dies
durch die Karzinomzellen determiniert ist, sollte für HPV-positive und HPV-negative
Karzinome getrennt untersucht werden. In diesem Punkt sind viele Arbeiten zur Prognose von
Faktoren des Tumormikromilieus nicht vergleichbar. Möglicherweise steckt im
Tumormikromilieu, auch Mikrobiom genannt, eine Erklärung für die gegenüber HPV-
negativen Plattenepithelkarzinomen einerseits unbehandelt schlechte Prognose mit bei
Diagnosestellung fortgeschrittenem Tumorstadium und andererseits das bessere Ansprechen
auf Strahlentherapie.
- 43 -
Eine Unterscheidung der Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches in eine T-
zellreiche Variante versus T-zellarme Variante oder intratumoral makrophagenreich versus
makrophagenarm hinsichtlich prognostischer Relevanz nach Radiation wäre untersuchenswert
und in Vorbereitung.
5.6 Limitationen der Arbeit
Für Studien an den Karzinomzellen selbst sind TMA sehr gut geeignet. Eine Einschränkung
gilt für diejenigen Parameter, für die eine Heterogenität im Tumor nicht ausgeschlossen ist.
Diese Limitation gilt für das Tumorstroma und Tumormikromilieu in besonderem Maße, da
es sich im Vergleich zu den Karzinomzellen nicht mal um eine ursprünglich monoklonale
Zellpopulation handelt. Für peritumorale Leukozyteninfiltrate ist diese Einschränkung auf
Basis der langjährigen Expertise in der histopathologischen Diagnostik als bedeutender
einzuschätzen als für intratumorale Leukozyteninfiltrate. Da die meisten signifikant
unterschiedlichen Ergebnisse das intratumorale Kompartiment betreffen, wird diese
Limitation der Methode als vernachlässigbar eingeschätzt.
Vor einer Verallgemeinerung der Ergebnisse und Vergleich mit anderen Arbeiten ist zu
berücksichtigen, dass nicht die absolute Zellzahl pro Fläche mit einer Software gezählt wurde
sondern eine definierte geringe Infiltrationsdichte versus einer hohen Infiltrationsdichte. Die
Alternative einer automatisierten Auszählung der Zellen mittels Software steht im Institut
nicht zur Verfügung. Eine Unterscheidung der intratumoralen und peritumoralen
Kompartimente sowie der verschiedenen Zelltypen wäre durch eine verfügbare Software
derzeit nicht zu leisten und mit unkalkulierbaren Fehlern behaftet. Es entspräche auch nicht
der diagnostischen Realität und hätte geringere Chancen der Translation in die
Krankenversorgung, sollten sich aus dieser histopathologischen Studie und deren
Folgestudien Konsequenzen für die Krankenversorgung ergeben.
Die Arbeit zeigt nur die Unterschiede zwischen HPV-positiven und HPV-negativen
Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches auf. Andere histologische Typen, z.B.
Adenokarzinome, neuroendokrine Karzinome oder sinunasale Karzinome wurden
ausgeschlossen. Auf Grund des Patientenkollektives aus der Klinik für Strahlentherapie sind
hier wie auch bei Ang und Mitarbeitern 2010 nur fortgeschrittene Karzinome der Stadien III
und IV nach AJCC eingeschlossen. Es gibt durchaus Hinweise, dass das Mikrobiom im
zeitlichen Verlauf einer Tumorentstehung und Tumorprogression in unterschiedlicher Weise
durch das Karzinom moduliert wird.
- 44 -
Da alle Lokalisation von HNSCC von Larynx bis Mundhöhle eingeschlossen sind, ist der
Anteil HPV-positiver Karzinome geringer als bei einer Fokusierung auf Karzinome des
Waldeyer’schen Rachenringes. Das Wissen um die unterschiedliche HPV-Prävalenz in den
verschiedenen Sublokalisation ergab sich erst im Verlauf dieser Arbeit.
Die Schnittpräparate paraffineingebetteter, formalinfixierter Karzinome zeigen zwar sehr gut
das Verteilungsmuster, in-situ-Morphologie und Infiltrationsdichte tumorassoziierter
Lymphozyten, aber erlauben keine Mehrfachmarkierung der Zellen, wie z.B. in der
Durchflusszytometrie, oder die Messung von Zytokinen, welche teils auch die Funktion und
den Aktivitätsgrad von Leukozyten definieren.
5.7 HPV-induzierte HNSCC sind eine eigene Entität
Zusammenfassend ist die eingangs formulierte Frage, ob HPV-induzierte
Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches im Vergleich zu HPV-negativen
Karzinomen mit einem morphologisch unterschiedlichen Mikromilleu einhergehen zu
bejahen. Unter anderem zusammen mit immunologischen Beobachtungen und einer besseren
Prognose nach Bestrahlungstherapie sollten Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches
in die zwei distinkten Untergruppen HPV-positiv und HPV-negativ klassifiziert werden,
zumindest solange sich kein anderes, am Biopsiematerial in der Krankenversorgung leicht
evaluierbares und die Unterschiede erklärendes Charakteristikum als dominant erweist.
- 45 -
6 Zusammenfassung
Kopf-Hals-Karzinome werden mit etwa 90% Plattenepithelkarzinomen als histologisch
weitgehend homogene Gruppe angesehen. Es dominiert die Kanzerogenese durch eine
synergistische Wirkung von Alkoholkonsum und Rauchen. Daneben entwickelt sich das
Modell der Kanzerogese durch humane Papillomaviren. Karzinome mit positivem HPV-
Status unterscheiden sich von HPV-negativen Karzinomen durch einen aggressiveren
Spontanverlauf und ein besseres Therapieansprechen auf Radiochemotherapie. Wichtig ist die
Definition des HPV-Status als Induktion des Karzinoms durch HPV mittels onkogener
Aktivität und Integration der HPV-Gene E6 und E7 in das Wirtsgenom. Methodisch hat sich
die Interpretation der immunhistochemischen p16-Expression als Zeichen der onkogenen
Transformation durch HPV gegenüber früheren Jahren etabliert. Frühere Arbeiten zur
Immunantwort auf Karzinome bzw. zum sogenannten Mikromilieu konnten den Faktor HPV-
induzierter Karzinome oftmals nicht hinreichend berücksichtigen. Die Frage, ob HPV-
induzierte Karzinome des Kopf-Hals-Bereiches (HNSCC) mit einem anderen Mikromilieu
einhergehen als HPV-positive Karzinome wurde hier mittels immunhistochemischer
Darstellung der Entzündungszellinfiltrate in 247 Karzinomen untersucht. HPV-positive
HNSCC unterscheiden sich gegenüber HPV-negativen Karzinomen durch:
- signifikant mehr peritumorale und intratumorale T-Lymphozyten (CD3)
- signifikant mehr intratumorale CD4-positive T-Helferzellen bei HPV-unabhängiger
peritumoraler T-Helferzelldichte.
- signifikant mehr intratumorale und peritumorale Effektor-T-Lymphozyten (CD8)
- signifikant mehr intratumorale zytotoxische T-Lymphozyten (TIA)
- signifikant mehr intratumorale Makrophagen
Hingegen sind die Dichte TIA-expremierender peritumoraler Lymphozyten, intra- und
peritumoraler PD-1-Expression auf Lymphozyten, intratumoraler Makrophagen, intra- und
peritumoraler Plasmazellen, peri- und intratumoraler B-Lymphozyten sowie das Vorkommen
peritumoraler Keimzentrumsfollikel statistisch unabhängig vom HPV-Status.
Ein solch distinktes Tumormilieu stellt eine histologisch andersartige Variante dar, die
potentielle Erklärungsansätze für einerseits aggressive Tumorprogression und andererseits
bessere Prognose unter Strahlentherapie vereint. Zukünftige Prüfungen von Medikamenten,
die auf das Tumormikromilieu wirken, wie z.B. Ipilimumab, Anti-PD-Ligand- oder Anti-
VEGF-Antikörper, sollte den HPV-Status und/oder die intratumorale T-Lymphozyten- und
Makrophageninfiltration berücksichtigen.
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8 Danksagungen
Ich danke meinem Doktorvater Prof. Dr. med. Christoph Thorns, Institut für Pathologie der
Universität zu Lübeck für die geduldige Unterstützung und insbesondere für die Etablierung
einer wissenschaftlichen Kooperation mit Prof. Dr. med. Dirk Rades und Frau Nina Seibold,
Klinik für Strahlentherapie, zur retrospektiven histopathologischen Aufarbeitung einer
Studienpopulation einer Strahlentherapiestudie aus der sich weitere gemeinsame
Publikationen ergaben und geplant sind. Herrn Prof. Rades danke ich für die Unterstützung
bei der statistischen Aufarbeitung. Frau Seibold danke ich für die Kooperation bei der
Material- und Datengewinnung.
Meinem Institutsdirektor Herrn Prof. Dr. med. Alfred Christian Feller danke ich für die zur
Verfügung gestellten Ressourcen dem Budget des Institutes und uneingeschränkte
Unterstützung.
Den erfahrenen und engagierten MTA Fr. Agnes Dummer stellvertetend für alle
Mitarbeiterinnen im Immunhistochemie-Labor sowie Fr. Tanja Oeltermann und Fr. Biggi
Steinfeld im Labor für Molekularpathologie danke ich für die ausgezeichnete
Schnittpräparate, Färbungen und ergänzende PCR-Untersuchungen. Herrn Prof. Jens
Habermann und Fr. Dr. Martina Oberländer danke ich für die Möglichkeit, den Manual Tissue
Arrayer1 einsetzen zu können.
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9 Lebenslauf 1977 geboren in Hamburg
1996 Abitur in Düsseldorf
Theodor-Fliedner-Gymnasium der evangelischen Kirche im Rheinland
1997-1998 Wehrdienst Sanitätsbataillon 7 Hamm/Westfalen mit Ausbildung zum
Rettungssanitäter in zivil-militärischer Kooperation mit Deutschem
Roten Kreuz
1998 -2004 Studium der Humanmedizin an der Georgia-Augusta-Universität
Göttingen und Universität Wien
mit Praktischem Jahr in Lüneburg (Innere Medizin Prof. G. Lankisch),
Jersey (Chirurgie) und Göttingen (Wahlfach HNO bei Prof. Dr.
Wolfgang Steiner)
2004 Joh. Heines-Wuppertal GmbH Nachf., Düsseldorf
Vertrieb und Entwicklung von Abrollbehältern Rettung für Feuerwehren
2005 Assistenzarzt Abteilung Strahlentherapie Reinhard-Nieter-Krankenhaus
Wilhelmshaven, Chefarzt Dr. Koch
2005-2008 Weiterbildungsassistent, Institut für Pathologie am Reinhard-Nieter-
Krhs. Praxis Prof. Dr. Gösta Fischer & Partner, Wilhelmshaven
seit 2008 wissenschaftlicher Mitarbeiter und Weiterbildung zum Facharzt für
Pathologie, Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Schleswig-
Holstein, Campus Lübeck, Direktor Prof. Dr. A.C. Feller
aktuelle ausgewählte ausserberufliche Tätigkeiten und Mitgliedschaften:
Vorstand Landesverband Schleswig-Holstein im Hartmannbund e.V.
Bundesarbeitskreise Weiterbildung und Assistenzärzte
Internationale Akademie für Pathologie e.V.
Vorstand Deutsche J/80-Klassenvereinigung e.V.
Teammanager Bundesliga-Mannschaft des Lübecker Yachtclub e.V.
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10 Publikationsverzeichnis
Originalarbeiten in Begutachteten Journalen 2009 bis 2014
1. Evers LH, Gebhard M, Lange T, Siemers F, Mailander P. Hibernoma-case report and
literature review. The American Journal of dermatopathology. 2009;31(7):685-6.
2. Bischoff P, Gebhard MP, Vogt FM. Endovaskulare Therapie einer
pulmonalarteriellen Pseudoaneurysmablutung bei unklarer pulmonaler
Raumforderung. RöFo : Fortschritte auf dem Gebiete der Röntgenstrahlen und der
Nuklearmedizin. 2010;182(4):361-3.
3. Laturnus JM, Gebhard M, Sommerauer M, Jocham D, Doehn C. Stromatumor der
Prostata von ungewissem malignem Potenzial (STUMP) - Ein Fallbericht. Aktuelle
Urologie. 2010;41(3):197-9..
4. Czymek R, Dinter D, Loffler S, Gebhard M, Laubert T, Lubienski A, Bruch, H. P.,
Schmidt, A. Electrochemical treatment: An investigation of dose-response
relationships using an isolated liver perfusion model. Saudi journal of
gastroenterology. 2011;17(5):335-42.
5. Czymek R, Gebhard M, Lubienski A, Roblick U, Bruch HP, Hildebrand P.
Intrahepatische Ablation: Radiofrequenzablation versus Elektrochemische Lyse.
Zentralblatt für Chirurgie. 2011;136(4):379-85.
6. Klotz S, Gebhard M, Sievers HH. Late left atrial thrombosis of an Amplatzer patent
foramen ovale occluder. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery.
2011;142(5):1270-1.
7. Rades D, Seibold ND, Gebhard MP, Noack F, Schild SE, Thorns C. Prognostic
factors (including HPV status) for irradiation of locally advanced squamous cell
carcinoma of the head and neck (SCCHN). Strahlentherapie und Onkologie.
2011;187(10):626-32.
8.
Bergmann PA, Liodaki ME, Mauss KL, Lange T, Gebhard M, Mailander P, Siemers
F Histologische und immunhistochemische Untersuchung zur Kapselfibrose im
Tiermodell - Vergleich zweier Implantate mittels einer histologischen Klassifikation in
Modifikation nach Wilflingseder. Handchirurgie, Mikrochirurgie, plastische Chirurgie.
2012;44(4):220-6.
9. Czymek R, Loeffler S, Dinter D, Gebhard M, Schmidt A, Jungbluth T, et al.
Intrahepatic radiofrequency ablation versus electrochemical treatment ex vivo. The
Journal of surgical research. 2012;174(1):106-13.
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10.Czymek R, Nassrallah J, Gebhard M, Schmidt A, Limmer S, Kleemann M, et al.
Intrahepatic radiofrequency ablation versus electrochemical treatment in vivo. Surgical
oncology. 2012;21(2):79-86.
11.Schroeder U, Gebhard MP, Wollenberg B. Dysplasien und Carcinomata in situ des
Larynx. HNO. 2012;60(1):41-3.
12.Linke R, Pries R, Konnecke M, Bruchhage KL, Boscke R, Gebhard M, Wollenberg B
Increased activation and differentiated localization of native and phosphorylated
STAT3 in nasal polyps. International archives of allergy and immunology.
2013;162(4):290-8.
13.Linke R, Pries R, Konnecke M, Bruchhage KL, Boscke R, Gebhard M, Wollenberg B
Glycogen synthase kinase 3 in chronic rhinosinusitis: two faces of a single enzyme in
one disease. Annals of allergy, asthma & immunology. 2013;110(2):101-6.
14.Rades D, Seibold ND, Gebhard MP, Noack F, Thorns C, Schild SE. Impact of the
HPV-positivity definition on the prognostic value of HPV status in patients with
locally advanced squamous cell carcinoma of the head and neck. Strahlentherapie und
Onkologie : Organ der Deutschen Rontgengesellschaft [et al]. 2013;189(10):856-60.
15.Rades D, Seibold ND, Schild SE, Gebhard MP, Noack F. Androgen receptor
expression: prognostic value in locally advanced squamous cell carcinoma of the head
and neck. Strahlentherapie und Onkologie. 2013;189(10):849-55.
16.Seibold ND, Schild SE, Gebhard MP, Noack F, Rades D. Prognostic impact of
VEGF and FLT-1 receptor expression in patients with locally advanced squamous cell
carcinoma of the head and neck. Strahlentherapie und Onkologie. 2013;189(8):639-
46.
17.Seibold ND, Schild SE, Gebhard MP, Noack F, Rades D. Prognosis of patients with
locally advanced squamous cell carcinoma of the head and neck. Impact of tumor cell
expression of EPO and EPO-R. Strahlentherapie und Onkologie. 2013;189(7):559-65.
18.Rades D, Seibold ND, Gebhard MP, Noack F, Schild SE. Fibroblast growth factor 2
is of prognostic value for patients with locally advanced squamous cell carcinoma of
the head and neck. Strahlentherapie und Onkologie. 2014;190(1):68-74.
19.Ellebrecht DB, Gebhard MP, Keck T, Kleemann M: Confocal laser microscopy in
minimal invasive surgery. Biomed Tech 2014; 59(s1)
20.Blank O, Bode F, Gebhard M, Hunold P, Brandt S, Bruder R, Grossherr M, Vonthein
R, Rades D, Dunst J. Dose-escalation study for cardiac radiosurgery in a porcine
model. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2014; 89(3):590-8
- 56 -
21.Quabius ES, Görögh T, Fischer GS, Hoffmann AS, Gebhard M, Evert M, Beule A,
Maune S, Knecht R, Ovari A, Durisin M, Hoppe F, Röcken C, Hedderich J, Ambrosch
P, Hoffmann M: The antileukoprotease secretory leucocyte protease inhibitor (SLPI)
and its role in the prevention of HPV-infections in head and neck squamous cell
carcinoma. Cancer Lett. 2014 Nov 24 (Epub ahead of print)
22.Huttenlocher S, Seibold ND, Gebhard MP, Noack F, Thorns C, Hasselbacher K,
Wollenberg B, Schild SE, Rades D: Evaluation of the prognostic role of tumor cell
podoplanin expression in locally advanced squamous cell carcinoma of the head and
neck. Strahlenther Onkol. 2014 Oct;190(11):1021-1027.
23.Schroeder U, Lauten M, Stichtenoth G, Gebhard MP, Buchholz M, Kaiser MM:
Laryngomalacia and Complicated, Life-threatening mTOR-positive Kaposiform
Hemangioendothelioma Cured by Supraglottoplasty and Sirolimus.
Klin Padiatr. 2014 Nov;226(6/07):362-368
24.Linke R, Pries R, Könnecke M, Bruchhage KL, Böscke R, Gebhard M, Wollenberg
B. The MEK1/2-ERK1/2 pathway is activated in chronic rhinosinusitis with nasal
polyps. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2014 Jun;62(3):217-29.
25.Rades D, Huttenlocher S, Seibold ND, Gebhard MP, Thorns C, Hasselbacher K,
Wollenberg B, Schild SE: Nuclear expression of p65 (RelA) in patients receiving post-
operative radiotherapy for locally advanced squamous cell carcinoma of the head and
neck. im review
![Lernmodul Linguistisches Propädeutikum - files.ifi.uzh.ch · Abbildung1.1:Die5HauptwortartennachGlinz[Stocker etal.2004] 1.3 Morphologische Merkmale MorphologischeKategorienundihreMerkmale](https://img.pdfslide.org/doc/110x75/5d61e3df88c993ea0c8b71b5/lernmodul-linguistisches-propaedeutikum-filesifiuzhch-abbildung11die5hauptwortartennachglinzstocker.jpg)
![Segmentierung von Halsstrukturen zur Operationsplanung Quelle: Anatomie des Menschen, Waldeyer und Mayet [1987]](https://img.pdfslide.org/doc/110x75/570491c41a28ab14218da5ea/segmentierung-von-halsstrukturen-zur-operationsplanung-quelle-anatomie-des.jpg)