{ ber alas optische Verhalten yon Safrtminen und Apo- safraninen in den verschiedenen Komponenten des

Protoplasmas Von

J o s e f Spek~ Rostoek ~

Mit 5 Textabbildungen

(Eingelangt am 6. Februar 1951)

Seiidem es mir gelungen war, yon vitalgefiirbten Zellen Spektren zu entwerfen, konnten Vitalfiirbungen aller Art einer genaueren optischen Analyse unterworfen werden. Erst auf diesem Wege konnte erkannt wer- den, daft zahlreiche Farbstoffe, wenn sic in bestimmter/ Substanzen der lebenden Zelle gelbst o,der yon ihnen adsorbiert sind, sich optisch anders verhalten als in einer Li~sung in Wasser. Ein besonders lehrreiches Beispiel dieser Art ist da s V e r h a l t e n y o n I r i s b l a u u n d a n d e r e n O x a z i n e n in P h o s p h a t i d e n (J. Spek , 1942). Das Spektrum yon Irisblau ist, wenn es innerhalb oder auferhalb der Zellen in den genannten Lipoiden gelbst ist, ein ganz anderes als das der wi/flrigen L6sung. Eine Bande desselben ist auferordentlich verstiirkt, eine ande.re dagegen viel schwiicher als im Spektrum der wiit3rigen Li~sung. Die erste Differenz beruht darauf, dal~ der Farbstoff in den Phosphatiden viel stiirker tluoresziert als in Wasser. Die Absorptionsbande des fluo~eszenzerregenden Lichtes liegt im sichtbaren Tell des Spektrums, und sic ist es, welche bei L6sung des Farbstoffes in Phosphatiden so sehr verstiirkt erscheint. Die Ver~inderung des Spektrums wirkt sich natiirlich auch im Farbton der Fiirb.ung aus, und die Verstiirkung der roten Fluoreszenz ist so enorm, daft vitalgefiirbte Zellen oder Zell- bezirke, in denen der Farbstoff in den Phosphatiden sitzt, auch schon bei blasser Anf~.rbung und nicht besonders starken Lichtquellen im gewbhn- lichen Dunkelfeldbilde in grellem rotem Licht erstrahlen.

Eigentlich deutet die starke Fluoreszenzsteigerung in der Zelle e i n e n w a s s e r f r e i e n O f t an. Sic tritt ni/mlich in allen wasserfreien organi- schen L~isungsmitteln ein. Es i s t da s W a s s e r , w e l c h e s d ie s t a r k e ]?' 1 u o r e s z e n z h e m mt. Haben die o,rganischen Li3sungsmittel relativ kleine Molekiile mit lipophilen und hydrophilen Gruppen, so verschwindet die starke Fluoreszcnz bei Zusatz yon Wasser augenblicklieh. Zwischen den mit Wassermolekiilen umlagerten hydrophilen Gruppen linden die an den

J Die meisten Versuehsserien wurden noeh im Zoologisdlen Institut in Heidel- berg ausgeftihrt.

240 J. Spek

lipophilen Gruppen des LSsungsmittels sitzenden rela~.iv grof~en Farb- stoffmolekiile offenbar nieht geniigend Raum, der yon Wasser fret bleibt, mn die starke Fluoreszenz zu entfalten. So liegen die u z. B. bet LSsungen des Farbstoffes in Methyl- o der 2~_thylalkohol. Die LSsungen in den reinen Alkoholen fluoreszieren sehr stark, die in verdiinntem A1- kohol ganz betriiehtlieh sehwiieher. W~ihlen wir dagegen LSsungsmittel, die neben einzelnen hydrophilen Gruppen grS[~ere lipophile Gruppen oder l~ingere Ketten mit lipophilen Eigensehaften im Molekiil besitzen, dann wird die Chance fiir den Farbstoff immer grSffer, daft seine starke Fluore- szenz aue]~ be t W a s s e r z n s a t z e r h a l t e n b l e i b t , da mit der Liinge der lipo.philen Gruppen die ,,wasserfreien Orte '~ im System immer grSfler werden. Das Extrem dieser Verhiiltnisse liegt bet den Phosphatiden vor, in denen der Farbsto.ff aueh bet starker Quellung des LSSungsmittels eine enorme Fluoreszenz zeigt. Einzelheiten miissen in der Originalarbeit naeh- gelesen werden, in de.r das u der Farbstoffe in ganzen Serien yon organisehen LSsungsinitteln besehrieben wurde. Hydrophile Gruppen muff das LSsungsmittel deswegen enthalten, weil das Farhsalz yon Irisblau in rein lipophilen LSsungsmitteln wie Xylol oder Neutralfetten unlSslieh ist. Bet allen Diskussionen fiber ,,LipoidlSsliehkeit" miissen wir immer klar tmterseheiden zwisehen LSsliehkeit in Lipiden (oder physikaliseh sieh ~ihn- lieh ,zerhaltenden anderen organischen LSsungsmitteln) mit rein lipophilen Eigensehaften und solehen mit lipophilen + hydrophilen Gruppen. Wie es aueh theo.retiseh erwartet werden muff, bestehen bet den allermeisten Farbsto.ffen betr~iehtlietle Unterschiede zwisehen ihrer LSsliehkeit in den beiden genannten Gruppen organiseher LSsungsmittel.

W~ire das Protoplasma ein wasserfreies Gemiseh organiseher Substanzen, so wiirden Irisblau nnd die anderen sieh entspreehend verhaltenden Farb- stoffe noch in vielen anderen Kompo.nenten des Protoplasmas das ,,Phos- phatidspektrum" und die starke Fluoreszenz zeigen. Bet dem tats~iehlieh vorliegendem hohen Wassergehalt dagegen diirften, naeh den zahlreiehen Modellversuehen zu sehliel3en, die Phosphatide meistens die einzige Stoff- gruppe sein, welche in der Zelle fiir die Entstehung des ,,Phosphatidspek- ~:rums" der in Frage stehenden Farbsto.ffe verantwortlieh zu machen ist.

Die pr~izise Unterseheidung yore ,,Wasserspektrum" und ,,Phosphatid- spektrum" der Farbstoffe ist bet den vitalgefiirbten Zellen vielfach dadureh ersehwert, daft uns die Konzentration des in einer Zellstruktur angereieher- ten Farbsto.ffes unbekannt ist und die Sehiehtdicke der gefiirbten Zone sieh racist nnr anniihernd bestimmen l~ifft. Wiirde die Liehtabsorption der Farb- Ibsnngen durchwegs dem Lambert-Beersehen Gesetz gehorehen, so wiirde dies weniger ins Gewicht fallen. Bet hSherer Konzentration oder grbl~erer Sehiehtdieke wiirden dana einfaeh alle Banden verstiirkt und verbreitert er- seheinen, und das Stiirkeverh~iltnis der versehiedenen Bailden wiirde - - yon ganz hohen Ko.nzentrationen abgesehen - - bet allen Konzentrationen im wesentlichen das gleiehe bleiben. Eine Herabsetzung der Farbkmazentration wiirde sieh stets so wie eine Verringerung der Sehiehtdicke auswirken, t?iir fluo.reszierende Farbstoffe trifft nun aber dies alles vietfach nieht zu. Ihre Liehtabsorption folgt nur teilweise dem Lambert-Beers&en Gesetz, denn da

t3ber das optis&e Verhalten yon Safraninen 241

die Fluoreszenzerregung in verdiinnten L6sungen, wie schort S t ok e s land, relativ viel starker ist, erscheint bei diesen Konzentrationen auch die Bande des fluoreszerlzerregenden Lichtes, verglichen mit einer Bande, welche mif der Fluoreszenzerregung nichts zu tun hat, betr~chtlich verst~rkt, und das Si~irkeverhalfnis der beiden Banden kann sich bei geniigend welt ausein- anderliegenden Konzenfrafionen so gar umkehren. So beruht bei IrJsblau, wie schon erw~ihnf wurde, die Spezifit~t des ,,Phosphatidspektrums" auf einer aulqerordentliehen Verst~rkung der Bande des fluoreszenzerregenden Lichtes (Bande 1). Sie ist in Phosphatiden (oder wasserfreien organischen LSsungsmitteln) vie1 st~irker als die Bande 3 (Bande des Farbions), die mit der Fluoreszenzerregung nicht viel zu tun hat, w~ihrend in h6heren Konzen- trationen der wM~rigen L6sungen oder bei starkeren Anf~irbungen yon rein hydrophilen Substanzen Bande 1 sehw~cher ist als Bande 3. Bei sehr ver- dilnnten w~iflrigen Lbsungen dagegen ist Bande 1 st~irker als Bande 3. Die Konzentration dieser LSsungen liegt zwar unter der in den vitalgef~irbten Objekten in der Regel vorliegenden Farbkonzentration, abet Kontrollen dutch Vergleieh des vitalgefiirbten Priiparates mit einer Farbliisung gleieher Sehiehtdieke und gleieher Farbstarke miissen immerhin ausgefiihrt werden nnd sind ziemlieh zeitraubend. So ging ieh, naehdem nun einmal der Weg eriiffnet war, mit Hilfe eines spezifisehen Spektrums an bestimmte Bausteine des Protoplasmas heranzukommen, darauf aus, aueh Farbstoffe zu linden, bei denen man nieht das variable Stiirkeverhaltnis yon Banden zur Unter- seheidung der Spektren nbtig hatte. Die verschiedenen Spektren yon einem solehen Farbstoff (Rose bengale G r i i b l e r ) habe ieh sehon in meiner Arbeit ~,on 1942 besehrieben. In der vorliegenden Arbeit sollen weitere Befunde dieser Art mitgeteilt wetden.

Dutch zuf~illige Beobaehtungen wurde ieh darauf aufmerksam, daft die gelbgriine Fluoreszenz yon S a f r a n i n in alkoholisehen Lbsungen viel star- ker ist als in Wasser. Ein soleher Untersehied der Fluoreszenzstiirke in Alkohol und Wasser ist fiir Safranin selbst und andere Safranine und Apo- safranine aueh in der Literatur verzeiehnet (vgl. G. S e h u l t z , Farbstoff- tabellen 1931). Die genauere Untersuehung lehrte, daft die Verh~iltnisse bei diesen Farbstoffen ganz iih~li& liegen wie bei Irisblau und den anderen yon mir beschriebenen Oxazlnen, daft abet die Spektren z. T. die gewiinseh- ten Vorziige gegeniiber denen der Oxazine zeigen und dal~ iiberdies einige der neuuntersuehten Farbstoffe zu Vitalfiirbungen ausgezeiehnet geeignet sind, so dal~ sie verdienen, in die mikroskopische Teehnik eingefiihrt zu wer- den. Eine Untersuehung des Ver haltens der Safranine ersehien mir aueh deswegen besonders interessant, da einige yon ihnen m e t a c h r o m a t i s e h e F a r b s t o f f e im Sinne der Histologen sind, d. h. m i t e i n e r b e s t i m m t e n G r u p p e y o n e r g a n i s e h e n S u b s t a n z e n , d i e m a n a n e h als c h r o m o - t r o p e S u b s t a n z e n b e z e i c h n e t (Kohlehydrate mit einer Schwefelsiiure- gruppe oder Eiweiflk6rpern, die eine solche Kohlehydratgruppe enthalten), e i n e n s p e z i f i s c J a e n , a n d e r s g e f a r b t e n K o m p l e x b i l d e n (vgl. J. S p e k 1940 und 1943, hier auch ~iltere Literatur), so daft Mso bei ihnen eventuell die MiSglichkeit besteht, ncch eine andere Gruppe von Zellsub- stanzen dutch eine spezifische F~irbung nachzuweisen.

Protoplasms, Bd. XL/2. 16

242 J. Spek

gersuehe mit Safranin T

Safranin ist ein basischer Farbstoff. Es hat die Formeh

H3C--[/<i-- N ={/X~--CH3

" , / \

CI C6H5

Der untere Benzo]ring kann eine Methy]gruppe tragen. Safranin T (Lud- wigshafen) is~ sowoh] in ~Tasser a|s aueh in abso]utem Alko]~ol gut 15slieh. In rein lipophi]en LSsungsmitle|n dagegen ist das Farbsalz unlSs]ich. ]:)as Farbpulver b]ei]M in Xylol und se]bst in geschmolzenem frischem Schweine- fett unge]Ssi. Aus neutra]en und se]~wach a]kalisehen w~f}rigen Far})]Ssun- gen treten beim ,Sehiitteln geringe Mengen der orangegelben Farbbase in Xylol iiber. Auch frisches Fett (Hammelfet't) f~irbt sich in solehen LSsungen b!aI} orangegelb an. Aus stark alkalis&en LSsungen l~i~f sich mit Xytot all- m~thlieh der ganze Farbstoff als Farbbase ansschiitteln. Die Anf~irbung vm~ Neutralfetten in schwach alkalischen FarblSsungen diirffe zu blafi sein, nm in mikroskopischen Schi&ten erkannt zu werden. Lecithin verhiilt sich auch diesem Farbstoff gegeniiber wie die anderen organischen LSsungsmittel, welche sowohl lipophile als auch hydrophile Eigens&aften haben (vgl. Aethylaikohol). Es fiirbt sich stark ,nit dem Farbsalz an. Auch bet dea Safraninen ist also die LSslichkeit in lipophilen + hydrophilen Lipoiden wesentlich anders als in den rein lipophilen.

In verdiinnten w~iflrigen LS.sungen ist eine diffuse, breite Bande mit einem schwach ausgepriigten Maximum bet 499 m u zu sehen. Abb. I a zeigt <[as Spektrum ether solchen LSsung, wie es sich im Engelmannschen Mikro- spektralphotometer bet einer Konzentration, die gerade noch das Maximum deutlich erkennen liifit, und einer SchichthShe yon 3 mm darbiete't} Das Spektrum ether alkoholischen LSsung yon gleicher Farbst~irke und Schicht- hShe zeig{ ein ganz anderes Bild (Abb. I b). In ihr ist zwischen etwa 525 und 540m# eine ha& oben seharf begrenzte, nach unten allmhhlich ab- nehmende Bande yon aul~erordenflicher Dunkelheit zu sehen, die ihr Maxi- mum bet etwa 536 m / hat. Im Bereich der marten Bande der w~illrigen LSsung ist in der alko.holischen kein Maximmn zu erkennen.

Belichtet man eine verdiinnte alkoholische LSsung ,-on Safranin mit dem Zeiflschen Monochromator bei ~erwendung ether Bogenlampe als Licht- quelle der Reihe nach mit mono,chromafischem, sichtbarem Licht aller Wel- lenlhngenbereiehe, dann kann man im dunklen Raum in einem ziemlich engbegrenzten Wellenl:dngelxbereieh, und zwar zwischen 528 und 550 nv~, ein

2 Die Abbildungen wurden naclt dem subjektiven Bild der Absorptionsbanden mit der Hand gezeidmet; sie kSnnen also ni&t als quantitativer Beleg verwendet werden, diirften abet dem Leser das gerst~indnis des Textes do& sehr erleichtern. Bei der Reproduktion ptlegt das Bild blasser Banden auch nur annhhernd so her- auszukommen, wie es in der Zeiehntmg ~orlag. -- Die }{erstellung photographisdmr Aufnahmen yon den yore Engehnannschen Mikrospektralphotometer' entworfenen Spektren stiel~ auf zu groi~e technisdm Sdlwierigkeiten.

12bet das optische Verhalten von Safraninen 243

sfarkes Fluoreszenzlicht auftre{en sehen. Be{ ungef~thr 535 m,~, wird es am a]lerhelMen~ un{erhalb 528m# wird es betriichflich sehw~icher, und ober- halb 550 ist'es kaum zu sehen. Da der Wellenlangenbereich der s6irksten Fluoreszenzerregung mit der starken Bande reeht gut zusammenfiill{, is{ diese als Absorptionsbande des fluoreszenzerregenden Liehtes aufzufassen. In den w~i~rigen Lbsungen trift be{ Belichtung mit dem monochromatischen Lichf nut ein ganz miifiiges Fluoreszenzlieht auf. Es geniigf abet, um fest- zustellen, daf~ die Fluoreszenzerregung im Bereich der Bande der wiifirigen Lbsungen, also be{ 499 m/z, keine Verst~irkung erfhhrt, eine schwache Ver- s~irkung des Fhmreszenzliehtes {st ~delmehr be{ ungefiihr 532m# zu er - kennen. Die ant Abb. 1 a eingezeichnefe Bande hat also im wesenflichen mit der Absorption des fluores- zenzerregeladen Lichfes niehts zu tun, wenn sie auch wahe- scheinlieh no cl~ yon einer sehr sdlwaehen diffusen Lichtab- sorptiou dieser Art iibertagert {st. Der Haupfabsorptions- be reidt des fluoreszenzerregen- den Lichfes liegt vielmehr auch in der wa~rigen L~isung un- gef~hr an der gleiehen Stelle Abb. i. a) Spektrum yon S a f r a n i n T in wie in der alkoholisehen (ira verdiinnter w~il~riger L6sung. b) Spektrum vojl

S a f r a n i n T in alkoholis&er L6sung glei&er Sinne der Kundtsehen Regel Farbstarke and Sehichth6he. e) Spektrum vor~ etwas naeh Violett versehoben), S a f r a n i n T in w~i~riger L6sung be{ Zusatz erscheint abet im Spektrum in- yon Agar (metachromatis&e Modifikation). folge der viel sehw~icheren Die Zahlen am Rande links bedeuten jeweils Fluoreszenz der w~iltrigen L6- Wellenl~ingen in m,-. sung nur als sehwaeher, dif- fuser Ausl~iufer der Bande naeh oben, der in dem relativ lichtschwaehen Engelmannsehen Mikrospektralphotometer kein Maximum erkennen l~tfit (G. S c h u l t z gibf fiir Safranin T extra ein schwaches, mit Fragezeichen ver- sehenes Maximum be{ 529 m# an). Fiir die Riehtigkeit dieser Dentung spricht das Aussehen des Spektrums einer ~r konzentrierteren, n:~imlieh 0,5%igen wiif~rigen LiSsung. Um ein solches zu erhalten, muff ein Tro.pfen der LiSsung zwisehen Objekitrager und Dechglas ausgebreitet und im Engelma~msehen Mikrospektralphotometer eingestellt werden. Durch Fliissigkeitsmengen grSfierer Schiehfdiche kSnnfe man ja be{ dieser Konzentratiou niehf durch- sehen. Das Spektrum zeigt eine sehr dunkle Bande an der Stelle der Bande yon Abb. t a. gntsprechend der in der konzentrierten L~Ssung viel sehwgche- ren Fluoreszenz fehlt aber der Ausliiufer dieser Bande naeh oben oberhalb 515 m# fast vollst~indig. Abso.rpfionsbanden yon fluoreszenzerregendem Lieht sind dutch einen seharfen oberen Rand ausgezeichnet. Er entsteht doff, wo die Liehtabsorption dureh das ausgesandte Fluoreszenztieht iiberstrahlt wird. Der obere Ausliiufer der Bande der verdiinnien w:,ifirigen LSsungen (vgl. Abb. t a) is{ nach Rot aueh dureh einen scharfen Rand begrenzt.

16"

244 J. Spek

hn Pri~zip liegen also die Verh~ihnisse bei Safranin ebenso wie bet iris- blau. Wahrend in den wasserfreien LiSsungen die Bande des fluoreszenz- erregenden Li&tes (Bande 1) entspreehend der sear verst~irkten Fluore- szenz sehr kraftig ist, liegt an ihrer Stelle bet den w~ifirigen LiSsungen nur eine sehwaehe diffuse Yerdunkelung, die aueh in den verdiinntesten LiSsun- gen mit relativ st~trkster Fluoreszenz hie stErker wird als die Bande bet 499 m# (Bande 2). Umgekehrt ist an Stelle der Bande 2, die in den w~if~.rigen LiSsungen aller Konzentrationen gut zu sehen ist, in den wasserfreien Me- dien keine als Bande in Erseheinung tretende Yersthrkung der Absorption zu erkennen. Diese Zone fiillt in den wasserfreien Medien noeh ganz in den Bereieh der Ausl~iufer der starken Absorption des fluoreszenzerregenden Lichtes. P r a k t i s e h i s t a l s o in b e i d e n K a t e g o r i e n n u r e i n e kr~if- t i g e B a n d e zu s e h e n , u n d da d i e M a x i m a d e r B a n d c n w e i r aus- e i n a n d e r l i e g e n u n d a n c h d a s G e s a m t b i l d de r B a n d e n z i e m l i e h c h a r a k t e r i s t i s e h is t , i s t e i n e U n t e r s c h e i d t t n g d e r F i i l l e m i t k e i n e r l e i S c h w i e r i g k e i t e n v e r b u n d e n . Bet den vitalgef~trbten Prli- paraten mu~ man nur eine zu starke Anfarbung, bet der die Lage der Maxima nicht mehr ermittelt werden kSnnte, vermeiden. Abet wenn die F~irbung wirktieh vital bleibe.n soil, dart man ja so stark gef~irbte Priiparate ohnehin nich~ verwenden. Abgesehen hievon gilt abet das P r i n z i p d e r U n t e r s e h e i d u n g o h n e K o m p l i k a t i o n e n f i i r a l l e K o n z e n t r a - t i o n s b e r e i c h e , und darin liegt eben der Vorzug des Safranins gegeniiber dem Irisblau. Die versehiedene Lage der Maxima bedingt aueh einen leieh- ten Unterschied des Farbtones der w~if~rigen und der wasserfreien L5sung. Beide Li3sungen sind zwar rot, da ja der Hanptteil der Banden in beiden Fallen in Griin liegt, abet die w~il3rige L5snng hat einen Stieh in Gelb, wahrend der Farbton der wasserfreien Lasung ein tiefes Rosa ist. Bet leicht getriibten oder gelbliehen Zellen kann inan allerdings gerade mit diesen Farbunterschieden niehts anfangen.

Bet Zusatz yon d~romotropen Substanzen seht~igt der Farbton der w~tf~- rigen L/Ssungen yon Rot naeh Orange urn. Bet Zusatz yon Agar versehiebt sich dabei die Bande his in die Gegend yon 460 bis 490 m# (vgl. Abb. 1 e). Die Lage des Maximums ist nicht leieht zu ermitte!n. Es liegt zwischen 470 and 480 m#, n~her bet 480. Genau den gleiehen Farbumsdfiag erhiilt man bet Aussalzung der w~il~rigen FarbliSsung, die sieh mit NaSCN besonders seh~n erreiehen liifit. Man erh~lf dabei sehSn durehscheinende orangefarbige Farbmassen, die im Mikrospektralphoiometer eine breite Bande zwischen 460 nnd 490mpL mit eiaem Maximum eiwas unterhalb 480m/~ zeigen. In beidetl F:dllen, bet der Entsfehung des dehydratisierten Komplexes yon Farb- stoff + Agar und bet der Entziehung des L6sungsmitfels dutch das 8alz, wird der Farbsto.ff, wie ich das schott fiir andere metachromatisehe Farbstoffe wahrscheinlich gemacht habe, jedenfalls in das andersgef~irbte Farbmotekiii iibergefiihrt. Darin erblicke ich die Erklhrung des Farbumsdflages bei der F~illungsmetaehromasie (vgl. J. Sp ek, 1940 und 1943).

Mit ether anderen chromotropen Substanz, der synthetisch hergestellten Arabylschwefelsgure, l~iltt sich auch bet Safranin keine so ganz vollstiindige ~)berfiihrung des Farbstoffes in die metachromatische Modifikafion erreichen.

Uber das optisehe Verhalten yon Safraninen 245

Das Maximmn der Absorption liegt bei Arabylschwefels~ure-Safranin bei 4S2 m~t, und die Bande greiff weiter fiber Griin hiniiber.

Vergleicht man die drei Spektren in der Abb. f miteinander, so sieht man, daft sich die drei F~tlle spezifischer Safraninfiirbungen leicht voneinander nnterscheiden lassen und jeder fiir sich geniigend charakterisiert ist. Ob wir freilich bei Anfgrbung des l e b e n d e n P r o t o p l a s m a s auch dem dritten Typ der Safraninfiirbung begegnen werden, ist nach allen unseren bisheri- gen Erfahrungen nicht sehr wahrscheinlich. Zur Entsfehung einer meta- dlromafischen Anf~irbung chro,motroper Subsfanzen geht~rt ja eine Ausf;il- lung yon diesen durch den Farbstoff (eine Komplexbildung zwischen chromo- troper Substanz und Farbstoff), und diese tritt erst bei viel hSheren Farb- sieffkonzentrafionen ein, als sie in der Regel bei Vitalf~trbungen verwendet werden (vgl. J. S p e k 1940 und 1943). Innerhalb der Zelle scheinen die (~romotropen Substanzen so stark hydrafisiert oder sonstwie gegen die Aus- f~llung geschfitzt zu sein, daf] selbst Konzentrationen des Farbstoffes, die aufierhalb der Zelle wirksam sind, wenn man sie in das Innere yon Zellen, die sicher chromotrope Substanzen enthalten, injiziert, keine spezifisch, e An- f~irbung der chromotropen Substanzen im metachromatischen Farbton her- beizuffihren vermSgen. Nut wenn die Bedingungen ftir eine direkte Ein- wirkung de~ Farbstoffes auf die chromotrope Substanz der lebenden Zelle so giinstig liegen wie bei den Am5ben, wo eine solche Substanz (wahrschein- lich ein Mukoid) die ganze Aufienfl~che der Zelle iiberzieht, kann man auch sehon an der lebenden Zelle eine metachromatische Anf~rbung der betreffen- den Schicht des Zellktirpers erzielen (J. S p e k und G. G i l l i s s e n 1943). Mit Safranin fiirbf sich dieses Grenzfl~ichenh~iutchen der AmSben orangefarbig an. Ander-e F~tlle yon einer vitalen Safr'aninf~trbung yon Zellstrnkturen im metachrc.matischen Farbtc.n sind mir nicht bekannt geworden, abet so]lien noch soldle gefunden werden, so sind wir jetzt jedenfalls in der Lage, sie, wenn sie nicht zu zart sind, auf dem optischen Wege als solche zu identifi- zieren, und Jm positiven Falle stehen uns dann auch noch alle die Kontrollen mit den anderen metachromatischen Farbstoffen zur Verfiigung, welche ich in de rmi t G. G i 1 i s s e n zusammen verSffeniliehten Arbeit yon 1943 zusam- mengestellt habe. - - In manchen F~illen diirfte ein Nachweis yon chromo- tropen Substanzen im Aufienmedium der Zellen yon Interesse sein.

Eine Anf~irbung yon lebendem Protoplasma durch die ebenfalls orange- farbige Farbbase diirfte kaum vorkommen, da unferhalb eines PH yon 9,0 kein Farbumschlag durch die alkalische Reaktion zu beobachten ist. Farb- ton der LSsung und Lage des Bandenmaximums bleiben innerha]b dieses weiten pri-Bereiches unverhndert. Eine elektive Anfiirbung rein lipophiler Substanzen (etwa Neutralfette) durch die Farbbase wird nach den Erfahrun- gen der Modellversuche zu schlieflen bei dem iiblichen PR des lebenden Protoplasmas jedenfalls sehr blafi bleiben. Wenn sie in Erscheinung treten sollten, liel3e sich mit Echtneublau leicht eine Kontrollf~irbung ausfiihren, ob wirklich lipophile Stoffe vorliegen (J. S p e k 1942).

Vitalf~irbungen wurden mit Safranin und den iibrigen Farbstoffen an den kleinen durchsichtigen Ovarialeiern yon S t i t 3 w a s s e r f i s c h e n , an den aus den Tieren herausgeholten Speicheldrtisen yon Chironomuslarven und

246 J. Spek

an Muskeln yon Blatta orientaIis ausgefiihrt. Die Fiirbungsversuehe mit Safranin lehrten, daft der Farbsto.ff die Phosphatide der Zellen sehr rasch anfarben mull E~ tritt sehon naeh kurzer Anf~irbung ein Spektrum mit einer starken Bande in der Gegend yon 540 m# auf, welches ganz dem Lecithin- spektrum entsprieht, nut meist etwas htiher liegt. Friiher o der sp~iter kann es dann noch zu einer fortsehreitenden Anfiirbung hydrophiler Substanzen (wohl der Eiwei~kiSrper) kommen, bei der die {iir die whl~rigen Lbsungen c:narakteristisehe tiefer gelegene Bande (naeh der Kundtsehen Regel etwas nach Re,t bis in die Gegend vo.n 505 m# versehoben) zu der Phosphafidbande hinzukommt. Einzelbeobaehtungert maehten es sehr wahr:seheinlieh, da[~ die Anf~irbung der hydrophilen Substanzen erst eintritt, were1 die Zellen sieh s&on nieht mehr in ganz einwandfreiem Zustand befinden. So konnte in mehrmals mit grol~.er Sorgfalt wiederholten Versuehen mit Ovarialeiern yon Leuciscus ruti lus festgestellt werden, daft am ersten Tag der F~irbungen dnzelne Eier tibermiil~ig stark und in mehr zinnoberrotem Farbton gefarbt waren, die neben der eharakteristischen Phosphatidbande aueh die Wasser- bande, zeigten, wetehe altm~ihlieh ebenso stark wurde wie Bande t. In diesen Eizellen waren die Kerne stets etwas ges&rumpft und das Plasma z. T. ]okal yon der Membran abgehoben. Alle anderen Eier zeigten pralle Kern- bl~ischen, normales Aussehen des Protoplasmas und waren alle gleiehm~fiig Blaf]rosa gef~irbt. Ihr Spektrum zeigte durehwegs nur die obere Bande, die zwisehen 530 und 545met lag. Bei liingerer D auer des Versuehes nahm die Zahl der Eier, die einen zinnoberroten Farbton annahmen nnd aueh Bande 2 zeigten, immer mehr zu, bis sehlieElieh die F~irbung bei allen Eiern diese Merkmale zeigte. Aueh bei Aufbewahrung der Objekte im Eissehrank emp- fiehlt es sich, die Vitalfiirbungen nieht liinger als 48 Stunden fortzuftihren. Vielleieht wird es spiiter, wenn mehr empirisehes Material vo.rliegt, mtiglieh sein, das Fehlen oder Vorhandensein der Bande 2 der Safraninfiirbung als Index fiir die friiher oder sp~iter einsetzenden Alterationen des Zustandes isolierter Zellen zu verwenden.

Bei den ausgefiihrten F~irbungen lagen die Banden, wie Tab. 1 zeigt,

Tab. 1. V i t a l f / i r b u n g e n mit S a f r a n i n T.

Ovarialeier x~on Barbus fluoiatilis

naeh 24 Sid.

De ntliche Bande bei 558--548 m,~t,

Gelbgriin auf- gehellt (Fluore-

szenz!). Yon der Bande abw~irts all-

m~ihlich abneh- mende diffuse Ver- dunkelung his Vio-

lett.

Ovarialeier 'r Leuciscus rutilus

nadl 48 Std.

Deutliche Bande yon 550--545 m~. Schw~iehere Bande

bei 503 m~.

Ovarialeier ~,on Lucioperca sandra

(Swinemiinde) nach 24 Std.

"Deutlidle Bande bei 540 m~.

Speicheldriisen yon Chirvnomuslarven

nach 24 Std.

Mfi~ig starke An- f/irbung, gut er- kennbare Bande

bei 540 m,u. S&wache Versfiir- kung bei 503 ml~.

l~ber das optis&e Verhalfen von Safraninelt 247

Bet den genannten Obiekten waren die mit Safranin T angef~irbten Phos- phatide gleiehmiiflig fiber die ganze Zelle verteilt.

Beimnuskeln yon Blatta orientalis zeigten nut eine sehwaehe Verdunke- lung zwisehen 530 und 540 m~. Aneh mit anderen Farbstoffen war bet die- sere Objekt nur eine sehr sehwache oder gar keine Phosphatidfiirbung zu erreiehen.

Im Dunkelfeld tritt die gelbgriine Fluoreszenz der mi{ Safranin ange- f~irbten Zellen oder toten M0dellstrbstanzen nur wenig hervor. Sie wird i~berdeekt yon der ziemlieh kriiftigell roten Eigenfarbe der angefiirbten Ob- jekte. In diesem Punkt liegen die u bet Safranin wesentlieh weni- ger giinstig als bet Irisblau, bet dem die Fluoreszenz absolut viel sfiirker ist, wiihrend die Fiirbnngen, sofern es sieh um Phosphatidfiirbungen handelt, stets sehr blal3 bleiben.

V e r s u c h e m i t a n d e r e n S a f r a n i n e n

Yon den iibrigen Safraninen, die untersueht wurden, bieten P h e n o - s a f r a n i n und R h o d u l i n v i o t e t t ftir die praktisehe Unterseheidung der beiden Haupt typen yon Pro toplasmasubstanzen weniger giinstige Verhglt- nisse, und tiber einige bet den Fgrbungen aufgetauehte neue Fragen l~il~t sieh auf Grund des bis jetzt vorliegenden Materials noeh kein sieheres Urteil fiillen. Im Prinzip liegen abet die Dinge, die uns hier interessieren, bet ihnen ebenso wie beim Safranin selbst.

Trotzdem die beiden Farbstoffe ehemiseh ziemlieh versehieden sind, wei- sen sie viele gleiehe Merkmale auf. Die L6sliehkeitsverhiiltnisse sind iihnlieh wie bet Safranin. In Wasser und Alkohol sind die Farbstoffe gut liSslieh. Xylol fhrbt sieh aus sehwaeh alkalisehen Lbsungen kaum merklieh an. Aueh frisehes Fett (Hammelfett) bleibt in solehen L6sungen ungef~irbt, tlanziges Fett dagegen f~irbt sich stark an, in Ilhodnlinvi~lett violettrosa, in Pheno- safranin rosa. Die hydrophile COOH-Gruppe der abgespaltenen Fetts/iure veriindert die Lbsliehkeitsverhiiltnisse des Fettes vollstgndig. Phosphatide fiirben sieh in Rhodulinviolett und Phenosafranin raseh und stark an. Bet Leiden Farbsfoffen ist die Fluoreszenz in wasserfreien Lbsungen viel st~irker als in Wasser oder rein hydrophilen Substanzen. Dementspreehend ist die einzige Bande, die in beiderlei Lgsungen zu sehen ist, in den wasserfreien Medien (in den Phosphatiden aueh bet Gegenwart yon Wasser) viel dunkler und sehiirfer als in Wasser.

In lebenden Zellen dringen die Farbstoffe ein. Am ersten Tag ist die F/irbung meist ziemlieh blal3.

Die genaueren Daten, die uns hier interessieren, sind in Tab. 2 zusammen- gestellt.

B e i d e F a r b s t o f f e sind m e t a e h r o m a t i s e h . Bet Zusatz yon Agar -r bet beiden die in Spalte 3 der Tab. 2 be:sehriebene Wasserbande fast vollst~indig, und es tritt eine neue sehwaehe Bande in Violett auf.

Wiirden nun bet den Vitalfiirbungen Banden auftreten, deren Maxima entweder ungefiihr dem der Wasserbande oder dem der Leeithinbande ent- spriiehen, so wiire eine sichere Entseheidung, weleher Typ yon Fiirbung vor-

248 J. Spek

liegt, infolge der grol3en N~he der Maxima reeht schwierig. Dazu kommt, dal3 ja beide Werte in den sfiirker l iehtbreehenden Protoplasmasubstanzen im Sinne der Kundtsehen Re~el etwas naeh Rot versehoben wfirden, wobei die Er fahrung gelehrt hat, da[~ der Betrag dieser Versehiebnng bet d e n ver- sehiedenen Zellen und versehiedenen Farbsioffen in no.eh nieht klar iiberseh- barer Weise ziemlieh stark var i ieren kann. ~berrasehenderweise ergab sieh nun aber ffir beide Farbstoffe in gleieher Weise bet Vitalf i i rbungen an reeht x, ersdaiedenartigem Zellmaterial eine fiber die sonst beobaehteten Abweiehun- gen no& welt hinausgehende, starke Versehiebung des Bandemnaximums naeh Ro.t his in die Gegend yon 570--580 m/~. Das wiire also ein Welle~- liingenbereieh, der um ungefiihr 50m# fiber dem Maxinmm der wh~rige~l

Tab. 2. F l u o r e s z e n z u n d S p e k t r e n v o n P h e n o s a f r a n i n und R h o d u l i n - v i o l e t t .

Farb- Spektrum in sioffe Fluoreszenz Wasser

Gelbgrtine Eine sehr breife Pheno- Fluoreszenz in safra- i Alkohol viel diffuse, blasse

nin st~irker als in Bande in Grtin. Wasser. Max. ca. 545 m~t.

In Alkohol sfarke Sehr verwaschene Rhodu- grtinbraune Bande, im oberen linvio- Fluoreszenz. In Griin. Max. ca.

left Wasser minimal. 546 ml~.

Spektrum in Spektrum in abs. Alkohol LeeKhin

Seharfe dunkle Bande um

542-- 553 m~. Max. bei 548 m~.

Krfiftige, scharf- umrissene Bande. Max. bei 550 m~.

Oberer Rand der Bande verst~irkt. Max. ca. 553 m.~.

Kr~iftige Bande. Max. bei 550 m}~.

LSsungen liegt und auch um fast den gleichen Betrag h5her liegt als das Maximum der Lecithinbande. Ob es Pho,sphatide gibt, welche auch im Mo- dellversuch bet Anfhrbung mit den beiden Farbstoffen eine so starke Rot- verschiebung der Bande zeigen, miissen erst kiinftige Versuche lehren, bisher konnte ich keines finden. Ein Vergleich mit den Verh~iltnissen bet Safranin und den wetter un ten zu beschreibenden Farbstoffen zeigt auch, da[] bet ihnen die Abweiehung der in den angef~irbten Zellen beobaehteten Banden- max ima ,con denen des Lecithins nirgends so gro.I~ is~, ja da[~ bet einigen Farbstoffen gegeniiber Lecithin sogar eine Differenz naeh der anderen Seite ~=orliegI. Mall wird daher geneigt sein, noeh einen anderen Fak to r zu suchen, weleher auf die Rotversehiebung der Banden einen Einflufl hat. I& mSehte diese Diskussion erst wieder aufnehmen, wenn mehr Beobaehtungsmateriat vorliegt.

Rhodulinviotet t und Phenosaf ran in zeigen beide das Ph~nomen der Yer- sehiebung des Bandenmaximums naeh Yiolett his an die Stelle des Absorp- t ionsmaximums des molekularen Farbstoffes in wiil3rigen Lbsungen sfeigen- der Konzentra t ion auf das Auffiilligste. Die u ko.mmt dann zustande, wenn der dissoziierte und rnolekulargel5ste Farbstoff ein ver- sehiedenes Absorp t ionsmaximum (und damit meist aueh eine versehiedene Farbe) haben und wenn die beiden Absorpt ionskurven e inander s tark iiber- sehneiden. L. L i s o n hat 1955 als erster bet den metaehrotnatisehen Farb-

giber das optische Yerhalten yon Safraninen 249'

stoffen auf die Erscheinung aufmerksam gemacht, sie aber etwas anders gedeutet und bei den Farbstoffen, die mehrere verschiedenartige Banden be- sifzen, in nicht ganz zutreffender Weise dargestellt (vgl. J. S p e k 1940, S. 538 ft.). Bet Rho,dulinviolett ha(e ine 0,01%ige LiSsung bet 200 C noch ein 7andenmaximum bet 546 m~t, eine 0,02%ige schon bet 550 m#, eine 0,04%ige bei 523 m#, und bet ganz kenzentrierten L~sungen riickt es schlieRlich noch wetter bis ins Violett herunter. Je h~her die Konzentration der Farbsalz- molekiile wird, um so mehr nhhert sich das Abso.rptionsmaximum dem des. ausgesalzenen Farbstoffes (495 m#).

Schtiefflich set nc.ch er-whhnt, da~ in Lbsungen vc.n Pheno.safranin in O!- s~ure, welche sich als Substanz mit lipophilen + h~drophilen Eigenschaften ebenfalls anf~rbf, die zun~ichst erscheinende krhffige Bande zwischen 550. und 560mu allmhhlich immer blasser wird und da~ start dessen eine zweite bei 522 m# gelegene Bande auffritt. Die Yerhnderung des Farbstoffes isf vielleicht auf eine • weise Reduktion zuriickzufiihren, denn bet lhngerem Stehen enifhrbt sich die Ols~ure- liSsung. Auch in naszierendem Wasserstoff wird der Farbstoff dutch Reduktion ~ l l i g ent- f~rbt. In ~ihnli&er Weise zeigt Rhodulinvio- left in Olsiiure und ranzigen l)'eften zwei Ba~- den, e ineetwash6heralsbeiLeci thin, niimlieh Abb. 2. a) Spektrum yon

B r i l l a n t r h . o d u l i n r o t B bet 551 m/~, nnd eine zweite bet 522 m/x. Eine in Wasser. b) Spektrum des Identifizierung yon Fetfen oder Olen, die un- Farbstoffes in absolutem gesiittigfe Fetfsfiuren enthalten, kiSnnfe aneh Alkohol. fiir den Cytologen bisweilen yon Interesse seth.

Yon den untersuehten Safraninen zeigt no eh B r i l l a n f r h o d u l i n r o t B yon den Oesiehtspunkfen der cytologischen Teehnik sehr beaehtenswerte Eigenschaffen. Der Farbsfoff ist verwandt mit Brillanfrhodulinviolett. Er ist in Wasser sehwaeh griingelb fluoreszierend, in absohtem Alko.hol und anderen wasserfreien Medien ist die Fluoreszenz wiederum betr~iehtlich st~ir- ker. Eine LiJsung erfolgt nut in rein hydrophilen und in hydrophilen + lipo- philen Medien. Lecithin und andere Phosphatide sind stark f/irbbar, in Xylol und neutrales Hammelfetf geht der Farbsfoff nieht hinein. Ranziges: Felt fiirbt sieh blat3-gelblieh-rosa an.

In Alkoho.1 und in angef~irbtem Lecithin ist in jedem Konzenfrations- bereieh eine sehr dunkle Bande zu sehen, die naeh ohen seharfrandig be- grenzt isf, naeh gioleft dagegen ganz allm~ihlieh ausl~iuft. Das Absorptions- maximum lieg[ in Alkohol bet 548, in pflanzliehem Lecithin bet 562 m u. ~ber der Bande ist Jn Griin und Gelb eine starke Aufhellung zu sehen (Fluore- szenzlieht!). In verdiinnfen wii~rigen Lbsungen gleieher Konzentration ist die der Alko.hol- bzw. Lecithinbande entspreehende Bande viel sehwgeher und schmiiler, fiber ihr ist abet in Griin und Gelb aueh bier eine dentliehe Aufhellung zu sehen. Abb. 2 isf eine Darstellung der Banden sehr ver- diinnier Lbsnngen gleieher Konzentration, a) in Wasser, b) in absohtem.

250 J. Spek

Alkohol, die bet 4 mm S .ch.ichth/3he ~lach dem sr~bjektiven Eindruck gezeichuet wurde. Sie zeig~, daft in Wasser die erw~ihnie Bande (die obere der beiden Banden der ABB. 2 a) unvergleiehlieh sehw~icher ist als die breite Bande der ~dkoholisehen L~isung und daft ihr Maximunl etwas h6her, und zwar bet 552 m,~, liegL Das Bemerkenswerteste abet ist ai~ dem W a s s e r s p ek t r u m, daft es z w e i B a n d e n zeigt. Das Maximum der unteren Bande liegt bet 5~2 m~. t~infache Versuche mit Konzentrationsserien kI~iren uns fiber de~ versehiedenen Charakter der beiden Banden auf. W~ihrend n'gmlich die vmtere Bande bet 5i2 rapt in den sehr verdiinn~en wiifirigen L~isungen nur ganz zart und viel schwiieher ist als die Bande bet 552, wird sie bei Konzen- irationserh6hung viel dunkler als die obere Bande, deren S6irke in hohen Konzentrationen abnimmt. In Decl<glaspr~iparaten 0,5%iger Ltisungen sieht man die obere Bande noeh, die untere abet ist unvergleichlieh dunkler und breiter. Da Brillantrhodulinrot B ein metaehromatiseher Farbstoff ist, also ~mders gefarbte Molekiile haben diirfte, ist wohl die Bande bet 5i2 m# im wesentliehen als Bande des Farbions aufzufassen. Sie tritt entsprechend der sehwiieherell Dissoziation des Farbstoffes in Alkohol in diesem nicht als selb- slhndige Bande in Erseheinung, ist wohl iiberlagert ~on dem Ausl~iufer der s~arken Bande bet 548 m,~c. Die obere Bande der w~iI~rigen Ltisung verh'g]t sieh im wesentlichen wie eine Bande des fluoreszenzerregenden Liehtes.

In sehr verdiinrtten w~il}rigen L6sungen ist die Bande bei 512 m/z im Engelmannsehen Mikrospektralphotometer nieht mehr zu erkennen. Der F'arbton dieser blassen Ltisungen ist aber in der Sehiehtdieke mikroskopiseher Pr~iparate nieht mehr zu sehen, so da~ .sie bet Vitalf/irbungssiudien nieht mehr in Betraeht gezo.gen zu werden brauehen. Fiir alle anderen bet der Vitalf~rbung in Frage kommenden Konzentrationsbereiehe gilt, d aft das S p e k t r u m des F a r b s f o f f e s in W a s s e r urtd h y d r o p h i l e n Sub- s t a n z e n s t e t s z w e i B a n d e r t a u f w e i s t , w i i h r e n d das P h o s p h a - t i d s p e k t r u m n u r e i n e k r ~ i f f i g e B a n d e ze ig t . Die Unterscheidung der beiden Haupttypen der F~rbung gestaltet sieh claher bet Brillantrhodu- linrot B ~iufierst einfadL

Da~ das Maximum der Alkoholbande etwas tiefer liegt als das der oberen ~'Vasserbande, braueht nicht unbedingi gegen die Kundtsche ltegel zu spre- d~en, naeh der man bet Alkohol eine Versehiebung der Banden nach 1lot er- warren miifite. Eine Versehiebung der Banden des fluoreszenzerregenden Liehtes kann aueh dadureh zustande kommen, daft die maximale ]~rregung der Fluoreszenz der Farbstoffe in den Medien x'erschiedener physikaliseher ]~esehaffenheit nicht bet der gleiehert Wellenl~inge erfolgt.

Brillantrhodulinrot B dringt in die lebenden Zellen ein. Es fiirbt das Protoplasma ziemlieh langsam an. Fiirbungen yon Ovarialeiern yon Leueis- cus rutilus und yon Speieheldriisen vort Chironomus-Larven waren am ersten Tag noeh ziemlich blafi, wurden aber dann am zweiten do& schon intensiv genug, um die Banden im Engelmannschen Mikrospektralphoto- meter aufs sch~irfste hervortreten zu lassen. Bet beiden Objekten trat dabei nur eine kriiftige Bande auf. Sie lag bet den Leuciscus-Eiern zwiseheI1 540 und 555 m# mit dem Maximum bet 552, bet den Speieheldriisen yon Chirono- mus-Larven bet 548 m}~. Auch wenn man die Fiirbung so lange fortfiihrte, bis

tdber das optische u yon Safraninen 251

die Bande des fluoreszenzerregenden Liehtes sehr krgftig wurde, trat keiue zweite Bande hervor, die der tmteren Bande des Wasserspektrnlns ent- sproehen hgtte. Yon der starken Bande abw~irts war Griin und Blau mittel- stark ~mrdun.kelt. In u ~'erlor sieh die Yerdunkelung allm~ihlieh. Es lag also offensiehtlieh eine Phosphatidfgrbung vor, die so wie alle anderen Phos- phatidfiirbungen bet diesen Objekten in allen Teilen des Protoplasmas gleieh stark auftrat.

Schiidigende Wirkungen des Farbstoffes waren nieht zu beobaehten. Die kleinen Ovarialeier der Fisehe btieben auch bet starker Anfgrbung in tadel- tosem Zustand erhalten. Die Kerne schrnmpften nieht.

Brillantrhodulinrot B ist ein sehwaeh metaehromatiseher Farbstoff. /vlit Agar gelang es mir nieht, einen Farbumsehlag oder eine Xnderung des Spek- trmns her]~eizufiihren. Bei Zusatz yon Arab3~lschwefels~iure dagegen wurde die Bande der w~il~rigen L/3sung bet 512 m# betriiehtlieh abgeschwiieht und verwaschen. Start dessen trai eine neue sehwa&e Bande bet 482 m/z auf. Die Band e des fluoreszenzerregenden Lichtes blieb unveriindert erhalten. Ein neuer Beweis fiir die -r Natur der beiden Banden[

Deutliehe Unters&iede in der Fluoreszenzstiirke will'tiger und alkoholi- scher LSsungen habe ieh noeh bet den Safraninen I r i s v i o l e i t , M a g d a l a - r o t und I n d a z i n beo]gaehtet. Bet Indazin ist die orangegelbe Fluoreszenz aueh in Alkohol sehwaeh, in der w~iflrigen Lbsung, die zudem aueh no& ein weil~liches Tyndallieht zeigt, ist sic kamn zu erkennen. Die anderen beiden Farbs[offe sind kriiftig fluoreszierend, da sic aber gegeniiber den oben be- schriebenen keinerlei Vorteile zu bieten sehienen, habe ieh an ihnen keine eingebenden Untersuchnngen angestellt. Erwiihnt set nut noch, daft Indazin ein metaehromatischer Farbsto,ff ist.

u mit Aposafr~ninen

Die Aposafranine unterseheiden sial1 yon den Safraninen dadurch, daf~ an einem der dutch die beiden Stickstoffatome miteinander' verbundenen Benzol- tinge oben noeh ein drifter Benzolring sitzt. Besonders v ide Versuche habe ich mit dem AposafraniI1 I n d u 1 i n s e h a r 1 a e h ausgefiihrt. Indulinscharlach hat die Strukturformel:

/ \ I ! I I

/ \ - - S - / \ / I - I

C1 C2Ha

Der Farbstoff i.st leieht ttislieh in Wasser und in Alkohol. Xylol f~irbt sioh beim Aussehiitteln neuiraler oder sehwaeh alkalischer Farbltisungen gelblieh- rot. Aus stark alkalisehen Ltisungen lgflt sieh der Farbstoff mit Xylol voll- st:,indig aussehiitteln. Die in das X3~lol iibergehende Farbbase hat die gteiehe Farbe und das glei&e Spektrum wie das Farbsalz. Frisches Hammelfett farht sich nur blafi, sgurehaltiges sehr stark gelbliehrot an. Aueh Lecithin

252 J. Spek

Parbt sieh raseh und stark an. An lebenden Zellen und Ge~eben lasscn sici~ mit Indulinseharlaeh sehr seh~ne u erzielen.

D'er Farbstci~' hat eine gelbe Fluoreszenz. Sir isf in Wasser nur sehwaeh. in Alkohol ~'iel st~irker. D ie w~il3rigen L b s u n g e n z e i g e n n u r e i n e ~ e r w a s e h e n e b r e i t e B a n d e , d e r e n M a x i m u m be | 4 9 7 m # l i egf . ~'rioleff und Blau sind miffelstark verdunkelt. Uber Griin geh{ eine miftel- starke u his in die Gegend yon 540 oder 5~0 m u (vgl. Abb. 3 a). Ganz anders siehf das Bild des S p e k f r u m s y o n de r a l k o h o l i s c h e n L tisu n g aus. Hier sind in verdtinn{en L~bsungen gleieher Konzentra{ionm~ z w e i s c h a r f e d u n k l e B a n d e n zu sehen (Abb. 3b). }n bezug auf die Zahl der Banden ]iegen also die Verh~il{nisse umgekehrf als be| Brillanfrhodulin-

ro~, wo die xvii~rigen Li3sungen zwei, die al- kolqolisehe nur eine Bande aufwies. In bezug auf die Absorptionsst~irke der be|den Type~l yon Li3sungen sfimmen die be|den Farbstoffe iiberein. Be| be|den sind die Banden der al- koholisehen Lbsungen unvergleiehlieh dunkler u~.d sch~irfer.

Das Maximum der oberen Bande der aI- koholisehen L{isung (Bande 1) liegt be| 532 m/.~,. das der u~teren Bande (Bande 2) an der glei- ehen Sidle wie in Wasser, nKmlieh be| 497 m#.

Abb. 3. a) Spektrum yon h t d e r Hi,he won Bande t der alkoho,lisehen Lib- | n d u i i n s c h a r I a c h in sung is{ in Wasser bei hoher Schiehtdieke eine Wasser, b) in absolutem AI-

kohol, ganz sehwaehe Verst~irkung der Absorption zu erkennen. Bei geringerer Sehiehtdieke *rift sir ni&t hervor. Das Bild des Spektrums bleibt

be| den L~Jsungen in Wasser be| allen Konzentrationen das glei&e. In Alkohol |st in mitfleren und hohen Konzen{rationen die untere Bande be| 497 dunkler als die obere. In seh~' verdiinn{en Libsungen l~igt sieh dieser Untersehied nieht mehr naehweisen, d. h. die beiclen Banden erseheinen gleieh stark, miissen also be| Yerdiinnung vers&ieden stark abgenommen haben. Es diirfte demnaeh ein geringfiigiger qualifafiver Unfersehied der be|den Banden vorliegen.

Die ganzen Untersehiede zwis&en dem Alkohol- und dem Wasserspek- ,,-tun attI' die im Alkohol sehr verst~irkfe Fluoreszenz zuriiekzufiihren, d iirffe ,erfehlt sein. Ein u mif dem iiberhaupt nieht fluoreszierenden Aposafranin A z o k a r m i n lehr{ nhmlieh, dal3 aueh be| diesem Farbstoff zwei ganz ~ihnlieh gelagerfe Absorptionsmaxima in Griin vorkommen und daft der ganze Wellenliingenbezirk miffelstark verdnnkelf isf. In Alkohol sind die be|den Banden anniihernd gleieh stark, in Wasser |st die o.bere sehwhcher als die untere. Das ~'ersehiedene Libsungsmiftel bewirkt also hier, aueh wenn keil~e versehieden starke Absorption des fluoreszenzerregenden Lichtes hin- zukommt, sehml eine gewisse Versehiedenheit der Spek{ren. Be| den fluores- zierenden Farbstcffen kommt dann hiezu noeh eine Versf~irkung der Lieht- ~bsorplion in den Wellenlhngenbezirken des fhmreszenzerregenden Liehtes.

E'ber das optisehe Verhalten von Safraninen 253

hinzu, und wenn diese in zwei Medien so sehr vers&ieden ist wie bet Was.set und Alkohol, dann kommen so aul3erordentli&e Versehiedenheiten der Spekt ren zustande, wie sic in Abb. 3 a und b yon einer verdi innten wiil3rigen und alkoholisehen LSsung gleieher Konzentra i ion dargestellt sin& Bet Azo- ka rmin sind die beiden Banden aueh in Alkohol so blafi und verwasehen wie in Wasser, t reten in der diffusen Verdunkelung im unteren Griin k a u m als Banden hervor, und von den regionalen Differenzen abgesehen ist im ganzen die Absorpt ion in Alkohol kamn stiirker als in Wasser. Dar in unterseheidet sieh der niehtfluoreszierende yon dean fluoreszierenden Farbstoff.

Die Farbe der verdiinnten w~il]rigen Ltisungen yon Indulinseharlaeh ist seharlaehrot, die der alkoholisehen mehr orange. In diinnen Sehiehten ist kein Farbunte rs&ied zu erkennen. In den Phosphat iden treten, wenn man sic mit der w~i[~rigen FarblSsung iibersehiehtet, so wie in absolutem Alkohol zwei Banden auf, die, wie in der Revel, etwas hSher liegen als im Alkohol. In pflanzliehem Lecithin liegen die Maxima bet 563 und 504 m#, in r anzigem Sehweinefetf Bet 552 und 512 m#. Ranzige Fette verhalfen sich immer wie lipophile + h)~drophile Substanzen.

Bet Yi{alfiirbungen ist die Unterseheidung yon , ,Phosphat idspektrum" nnd , ,Wasserspektrum" denkbar einfaeh. Fiir alle Konzenira t ionen gilt, daft das Phosphaf idspek t rum zwei Banden haben mul], w~ihrend das Wasser- spek t rum nur eine Bande aufweist. Die Deutung der Ergebnisse der Vital-

Tab. 3. V i t a l f / i r b u n g e n mi t I n d u l i n s e h a r l a c h .

Ovarialeier yon Leuciscus rutilus

F~rbung scharladlrot. Zwei s&Sne, krMtige Banden zu sehen. Bande 1 Max. 542 m,u, Bande 2 Max. 504 m~, Bande 2 kr~iftiger. Anch Grtinblau, Blau und Blauviolett ziemlieh ver- dunkelt. St/irker als Feld zwischen den Banden. Eier

tadellos erhalten.

Ovarialeier yon Lueioperca sandra (Swinemiinde)

Zwei Banden. Bande t 540--552 mtt, Max. 54~ m#, Bande 2 498--512 met, Max. 503 re,u, Bande 2

kr/iftiger.

Speicheldriisen yon Chiro- nomus-garven

Zwei krMtige Banden. Bande I Max. 543 mt~, Bande 2 Max. 505 m,u. Untere Bande kr~iftiger, greift naeh Blauviolett tiber. Aueh Feld zwischen den Banden verdunkelt.

Suspension yon Ascites- Nervus ischiadicus yon Muskulatur yon Blatta Careinomzellen der Maus I Rana esculenta crientalis

Suspension erseheint en masse scharlachrot. Zwei starke Banden zu sehen. Bande Max. ca. 542 m#, Bande 2 Max. ca. 502-- 505 m/~. Nicht einzelne

Zellen eingestellt.

Deuthehe scharlaehrote An- ! f/irbung. Zwei unscharfe,

breite Banden si&tbar. Das ganze Feld zwisehen 490 und 552 m~, mittel- stark verdunkelt. Bande 1 Max. 543 m/~, Bande 2 Max.

~ 505 m~, Bande 2 wesent- lidl krMtiger.

Nur eine breite Bande von Mitre Grtin bis Violett. Deutliehe Verst~irkung zwisehen 4S5 und 500 mtt,

Max. ca. 497 m~.

254 J. Spek

f:,irbungen, die an versehiedenartigstem Material ausgefiihr{ wurden, bereitet daher keine SehwierigkeKen. Das Wichtigste da~on ist in Tab. 3 zusammel\- gesiellf.

Zu den mitgeteilien We,rten set noch bemerkt, da[~ Untersehiede yon eini- gen 1Wt bei Messungen mit dem Enge,lmannsehen Mikrospektralphotomefer noeh in die Fehlergrenze fallen. Die Skala gibt Werfe yon 10 zn 10 m# am Die Lage der dazwisehenliegenden Maxima muff gesehfitzt werden.

Bet Nerven miissen die Nervenfasern zwecks Anfhrbung gelockert wer- den. Wegen der vielen reflektierenden Flhchen gibt dieses Objekt auch bei Anf~irbnllg mit anderen Farbsto.ffen s~e~s unseharfe Banden.

Abweiehend yon allen anderen Objelcten zeigt die Muskulafur yon Blatta orientalis eine reine ,,Wasserbande". Der Farbstoff mu~ also in den Eiweifi- k6rpern o der anderen rein hydrophilen Substanzen sitzen. Es wurde sehon erw~ihnt, daft auch andere Farbstoffe bet diesem Ob~ekt nur eine sehr sehwaehe oder gar keine Lipoidf~[rbnng gelgen.

Weder Indulinseharlaeh neeh Azokarmin geben mit ehromotropen Sub- stanzen metaehromatisehe Umsehl~ige. - - Azokarmin wird won den physio- !ogiscllen Medien ausg'eflo:ckL Es f~[rbt lebende Zellen nicht an.

Zusammenfassung

Auch unter den basisehen Safranlnen und Aposafraninen gibt es eine ganze Reihe yon Farbstoffen, welehe so wie Irisblau und die anderen yon mir beschriebenen Oxazine in wasserfreien organischen LSsungsmitteln viel st~[rker iluoreszieren als in Wasser und dementspreehend eine viel st~irkere Absorpfionsbande des fluoreszenzerregenden Liehtes zeigen als in wfifl.rigen LiJsungen. Meist handett e s sich um eine griine oder gelbgriine Fluoreszenz, und die am sthrksten erregenden Wellenl~ingenbereiche liegen im siehtbaren Teil des Spektrums. Anch aut~er dieser Differenz kSnnen noeh eharakteri- stisehe Unterschiede zwisehen dem Spektrmn der w~t~rigen und der wasser- freien Lbsung vorhanden sein.

In rein lipophilen Medien lust sieh das Farbsalz der Farbstoffe nieht, es ist nur in lipophilen + }tydrophilen und in den rein hydrophilen Substanzen gut liSslieh. In niedermolekularen l ipo.philen+hydrophilen Stoffen ver- sehwindet die starke Fluoreszenz bei Wasserzusatz wieder. In den hoehmole- kularen lipophilen + hydrophilen Stoffen bleibt sie aueh bei Wasserzusatz erhalten, weil die Farbstoffe an den grol]en ]ipophilen Gruppen offenbar geniigend grofle wasserfreie Orte linden, wo ihre Fluoreszenz nieht gehemmt wird. Naeh bisherigen Ergebnissen der Modellversuehe sind es unter den Bedingungen in der Zelle die Phosphatide allein, wel&e die Fluoreszenz- steigerung und das ,,Phosphatidspektrum" zeigen. Das Yerhalten der Farb- stoffe in Fetten, welche Fetts~iuren oder andere lipophile + hydrophile Stoffe enthalten, wurde 13esonders beriicksiehtigt.

Ein u der Safranine und Apnsafranine gegeniiber Irisblau besteht darin, dal~ (lie Untersehiede zwisehen ,,Wasserspektrmn" mid ,,Phosphatid- spektrum ~ fiir alle bei der Vitalfiirbnng praktiseh in Frage kommenden Konzentrationsbereiehe gelten.

t~ber das optische Verhalten yon Safraninen 25,~

,,Wasserspektrum ~ und ,,Phosphatidspektrmn" sind besonders leieht zu unterseheiden, wenn die Maxilna der Hauptbanden in den beiden Fiillen welt auseinanderliegen (wie etwa bei Safranin) oder wenn ein Spektrum zwei, das andere dagegen nut eine Bande zeigt, wie bei Brillantrhodulinrot und Indulinscharlaeh.

Unter den Safraninen gibt es zahlreiehe metaehromatisehe Farbstoffe, die mit ehromotropen Substanzen einen Farbumsehlag geben. Sitzt der Farb- stoff in einer solehen Substanz, so gibt er wiederum ein eharakteristiseh an- deres Spektrum. Die Bande yon diesem liegt zwar an der gleiehen Stelle wie die der Farbbase, do& diirfte bei Vitalf~irbungen eine Anfiirbung dutch die Farbbase wegen des ho,hen Umsehlagpunktes der Farbstoffe und wegen des bei niederer Alkalinitiit nut sehr geringfiigigen ii~bertrittes der Farbbase in lipophile Substanzen kamn vorkommen.

Die untersuehten Farbstoffe fluoreszieren s, iel schw~idler als Irisblau. Eine Unterseheidung der versehiedenen Typen der Fiirbung dureh die versehie- dene Intensit~it des Fluoreszenzli&tes im Dunkelfeld ist bei den Safraninen und Aposafraninen ni&t m[iglieh.

Safranin T, Brillan[rhodulinrot B, Rhodulinviolett, Phenosafranin und !ndulinseharlaeh sind zu u sehr gut zu verwenden. Sie sind ungiftig. Die sehtinsiert u erhielt ieh mit Indulinseharlaeh.

Aueh die Versuehe mit den Safraninen und Aposafraninen lehren in ein- dringlieher Weise, 'dal3 die Farbstoffe in rein lipophilen und in lipo- plfilen + hydrophilen Substanzen sehr versehieden li~slieh sin& Alle Lipoid-- theorien kranken sehr daran, daft diese Unterseheidung nieht gemaeht wor- den ist.

Die Spektren yon den -vitalgefiirbten Zellen wurden mit dem Engehnann- sehert Mikrospektralphoiometer entworfen. Die Bestimmung der Maxima der Absorptionsbanden ist mit dem Engelmannsehen Mikrospektralphotometer nieht mit soleher Sicherheit zu erreiehen wie mit einem gro~en Spektroskop. Es ist mbglich, dal3 sieh dadureh geringfiigige Fehler ergeben haben. Da es abet bei den biologisehen Betraehtungen aussehliel~lieh auf die D i'f f er e n- zen in der Lage der Maxima zweier Spektren ankommt und diese bei den l~evorzug ten Farbstoffen sehr weir auseinanderliegen, habe ieh nut z. T. Kon- trollen mit grol~en Apparaten ausgefiihrt.

Literatur

Lison, L.: Archiv de Biol. 46, 599--669 (1935). Sehul tz , G.: Farbstofftafeln, 7. Aufl., Leipzig 1951. Spek, J.: Protoplasma 54, 555--584 (1940). Hier ~iltere Literatur fiber Meta-

ehromasier. 57, (49--85) (1942). Hier ~iltere Literatur fiber Lipoidf/irbungen. Je-- naisehe Zeitsehrift 77, 48--67 (1944).

Spek, J., und Gi l l i ssen , G.: Protoplasma 57, 258--272 (1945).