This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

FLUORESZIERENDE STOFFE IN DEN AUGEN DREIER GENOTYPEN 687

male Doppelbrechung auf die sichtbaren F aser­elemente zurückgeht und daß die Photoelastizität ein Ausdruck gummi-elastischer Eigenschaften der in terfib rillären M atrix ist.

Abschließend kann gesagt werden, daß das Binde­gewebe der Insekten einen komplexen A ufbau zeigt

und sicherlich nicht m it dem der W irbeltiere iden­tisch ist. N ur durch eine tiefgreifende Analyse mit verschiedenen M ethoden w ird es gelingen, die ein­zelnen Gewebekomponenten zu erfassen, ihre Zu­sam m enhänge zu erkennen und ih re funktionelle Bedeutung zu verstehen.

Uber die fluoreszierenden Stoffe in den Augen dreier G en o ty p en von Plodia interpunctella

Von F rancisco F e r r a n d d e A lm e id a *

Aus dem Max-Planck-Institut für Biologie, Abteilung K ü h n , Tübingen (Z. Naturforschg. 13 b, 687—691 [1958] ; eingegangen am 22. Juni 1958)

Qualitativ gleichen sich die drei papierchromatographisch untersuchten Genotypen von Plodia interpunctella weitgehend; von den fluoreszierenden Substanzen der Augen wurden festgestellt: Isoxanthopterin, Xanthopterin, 2-Amino-6-hydroxypteridin, die Pteridine cx und e, und die noch nicht näher untersuchten Stoffe b, gr und g'. e und 2-Amino-6-hydroxypteridin stehen bei Stamm 6 in negativer Korrelation zueinander. Quantitativ übertrifft die rotäugige M utante ra die beiden anderen Genotypen vor allem durch die cr und e-Substanz. Stamm 6 enthält sehr viel 2-Amino-6-hydroxypteri- din, während die anderen Stoffe stark reduziert sind. Der Wildtyp und die rotäugige M utante von Plodia gleichen fast völlig den entsprechenden Genotypen von Ephestia.

Die A ugenfarbm utanten von E phestia unterschei­den sich nicht nur im Pigm entgehalt, sondern auch in ihrem M uster fluoreszierender Substanzen1. Bei der gleichfalls zur Fam ilie der P yra lidae gehörigen, nahe verw andten A rt P lod ia in terpunctella wurden neben der W ildform noch eine rotäugige ( ra )2 und eine schwarzäugige M utante (Stam m 6) isoliert. Es erschien nun wünschenswert festzustellen, ob auch in diesen Fällen genspezifische Fluoreszenzm uster in A bhängigkeit von der A ugenfarbe aufzufinden seien.

F ü r die A nregung und Förderung zu dieser A rbeit b in ich H errn Professor Dr. A l fr ed K ü h n

und H errn D r. A lbrecht E gelh a af zu Dank ver­pflichtet.

Material und Methode

Die folgenden Stämme von Plodia wurden verwendet:a) Stamm 1, Augen dunkelbraun (Wildtyp).b) Stamm 13, Augen rot (ra ).c) Stamm 6, Augen schwarz.

Die Tiere wurden im Dunkeln bei 29 — 30u C und 60 — 70% relativer Luftfeuchtigkeit gezüchtet.

* Ausgeführt mit Unterstützung der A l e x a n d e r v o nH u m b o l d t - S t i f t u n g und des „ I n s t i t u t o d eA 1 1 a C u 1 1 u r a“ in Lissabon.

1 E. H a d o r n u . A. K ü h n , Z. Naturforschg. 8 b, 582 [1953].

Zur papierchromatographischen Untersuchung wur­den die Köpfe in einem Gemisch von Methanol (75 Tie.) und 1-proz. Ammoniak (̂ 25 Tie.) zerrieben und der überstehende Extrakt nach Abzentrifugieren auf Chro- matographier-Papier (Whatman Nr. 1) aufgetragen. Für ein eindimensionales Chromatogramm (Laufmittel: Propanol-lproz. Ammoniak 2 : 1) wurden 5 (in 0,1 ml Methanol-Ammoniak), für ein zweidimensionales (Propa- nol-Ammoniak, Butanol-Essigsäure) 10 Köpfe (in0.2 ml) verwendet. Die ganze Behandlung wurde zum Schutz der photolabilen Substanzen bei Rotlicht durch­geführt. Die Auswertung erfolgte fluorometrisch direkt vom P ap ier3’ *’5. Die Bezeichnung der noch nicht iden­tifizierten Stoffe mit Buchstabensymbolen entspricht der bei Ephestia benutzten1.

Ergebnisse

1. Q u a l i t a t i v e V e r t e i l u n g d e r S t o f f e

Das Fluoreszenzm uster von P lod ia (Abb. 1; Tab. 1) um faßt folgende Flecke: b, cx , gr, e, Iso- xanthopterin (g ), X anthopterin (h ) , g und 2- A m ino-6-hydroxypteridin (kx). D er grün fluoreszie­rende Fleck gr, der wahrscheinlich dem „d-Stoff“ von E phestia entspricht, kom m t nu r beim W ildtyp vor; anderseits tr itt bei Stam m 6 ein blauvioletter

2 F. F. d e A l m e id a , Z. Naturforschg. 13, 617 [1958].3 A . K ü h n , Naturwissenschaften 42, 529 [1955].4 A . E g e l h a a f , Z. Vererbungslehre 87, 769 [1956].5 E . R e is e n e r - G l a s e w a l d , Z. Vererbungslehre 87, 668 [1956].

6 8 8 F. F. DE ALMEIDA

Abb. 1. Anordnung der fluoreszierenden Stoffe aus Köpfen vom Wildtyp (a) und Stamm 6 (b) von Plodia interpunctella auf zweidimensionalen Chromatogrammen. I —III : Flecken gruppen der eindimensionalen Chromatogramme (Abb. 4).

Abszisse: R f-Werte in Butanol-Essigsäure. Ordinate: R f-Werte in Propanol-Ammoniak.

Fleck (g ') auf, der den ändern Stäm m en fehlt; gr und g treten nur in sehr geringer Menge auf. Die drei Genotypen stimmen daher im wesentlichen qua­litativ überein.

Der bei E phestia beschriebene „f-Fleck“ ist auch bei allen drei P/ocfo’a-M utanten nachweisbar, da er aber durch einen braunen Fleck teilweise verdeckt wird, wurde er nicht weiter berücksichtigt.

Es war festgestellt worden, daß der „ k-Fleck“ bei E phestia aus zwei blau fluoreszierenden, photolabi­len Stoffen besteht (kj und k2) 6' 7,8, von denen der erstere dem 2-Am ino-6-hydroxypteridin und der zweite dem noch nicht völlig aufgeklärten P terid in

„HBo“ von D rosophila entspricht. Aus diesem geht durch UV-Bestrahlung u. a. die 2-Amino-6-hydr- oxypteridin-8-carbonsäure hervor.

Zur Untersuchung des k-Flecks von Plodia wurden aus zweidimensionalen Chromatogram men die betref­fenden Flecke ausgeschnitten und 1/2 Stde. in dest. W as­ser gelegt. Von dem E luat wurden auf 2 Chrom ato­gramme je 2 Flecke aufgetragen und auf dieselben B lätter als Kontrollen 2-Amino-6-hydroxypteridin, die entsprechende Carbonsäure (8) und „HB2“ *. D er eine Fleck des Extrakts wurde jeweils mit UV bestrahlt (8 M in.). Als Lösungsmittel dienten N H 4C1 (3%) und N a2H P 0 4 (15%). Der Versuch wurde mit M aterial von jedem der drei Stämme durchgeführt.

Meßgruppe Fleeken-Nr. Fluores­zenzfarbe

R f in Pro- panol-XH3

R f in Butanol -Essigsäure n

I bClgr

orangeeisgrüngrün

0.070,100.14

0.080,150,22

2626

4II e

Isox.g'

X anth.

eisgrün violettbl. violett bl. blaugrün

0.190,180,260,25

0,160,230,160.23

2626

926

II I 2-A-6-hpt.. blau 0.35 0,33 26

Tab. 1. Fluoreszenzfarbe und ß/-W erte der fluoreszierenden Substanzen aus Köpfen von Plodia interpunctella. n = Anzahl der untersuchten Flecke. Isox. = Isoxanthopterin; X an th .= X anthopterin; 2-A-6-hpt. = 2-Amino-6-hydroxypteridin.

6 A. E g e lh a a f , Naturwissenschaften 43. 309 [1956]. 8 M. V is c o n tin i , A. K ü h n u . A. E g e lh a a f , Z. Naturforschg.7 M. V is c o n tin i, E . L o e s e r u . A. E g e lh a a f , Naturwissenschaf- 11b , 501 [1956].

ten 43, 379 [1956]. * Für die Überlassung der reinen Substanzen danke ichHerrn Prof. M. V is c o n tin i , Zürich.

FLUORESZIERENDE STOFFE IN DEN AUGEN DREIER GENOTYPEN 6 8 9

Die E rgebnisse w aren im m er gleich (Abb. 2) :1. D urch B estrahlung entsteht aus k kein Photolyse-

produkt,2. der Fleck aus der nicht bestrahlten Probe w an­

dert einheitlich, und3. beide Flecke (bestrah lt und nicht bestrahlt) zei­

gen genau denselben 7?/-Wert, den des 2-Amino- 6-hydroxypteridins.

Rf0,7

0.6

0.5

I 'oy 1<h0-3

^0,2

Abb. 2. Eindimensionales Chromatogramm von k-Extrakten aus Köpfen von Plodia und verschiedenen reinen Stoffen als Vergleichsubstanzen, a k-Extrakt mit UV (365 m^a) bestrahlt, b derselbe nicht bestrahlt, c 2-Amino-6-hydroxypteridin, d

„HB2“, e 2-Amino-6-hydroxypteridin-8-carbonsäure. L aufm ittel: NH4C1-Lösung.

Danach kann k von P lod ia als einheitliche Sub­stanz (2-A m ino-6-hydroxypteridin) angesehen w er­den ; „k2“ ( = H B 2) kom m t im Gegensatz zu E phestia nicht vor.

D a der g -F leck in der Fluoreszenzfarbe (violett­blau) dem Isoxanthopterin gleicht, wurden noch die ähnlich fluoreszierenden Derivate Isoxanthopte- rincarbonsäure und Isoxanthopterinessigsäure zum Vergleich aufgetragen; g ist jedoch auf G rund der .fy-Werte m it keinem dieser beiden Stoffe identisch.

2. Q u a n t i t a t i v e V e r t e i l u n g d e r S t o f f e

Q uantitativ unterscheiden sich die drei Geno­typen sehr sta rk (Abb. 3 ; Tab. 2 ) . Vergleicht m anden W ildtyp m it der rotäugigen M utante, so siehtm an, daß bei der letzteren alle fluoreszierendenStoffe m it A usnahm e von k in größerer Menge vor­handen sind. A ußerordentlich hoch ist die Fluores­zenzintensität des e-Flecks. D am it stim m en der Wild­ty p und d ie ro täu g ige M utante von P lod ia m it den

entsprechenden G enotypen von E phestia (a und a) vö llig überein .

Im Gegensatz dazu sind — w ieder m it Ausnahm e von k — bei Stamm 6 alle Fluoreszenzstoffe in viel geringerer Menge vorhanden als beim W ildtyp. Be­sonders auffallend ist die hohe K onzentration an 2-Am ino-6-hydroxypteridin, durch welche Stamm 6 an die M utante bch von E p h es tia 1,5 erinnert. Durch das (wenn auch schwächere) V orhandensein der übrigen fluoreszierenden Stoffe unterscheidet sich Stamm 6 aber wesentlich von bch.

Vergleicht m an die A ugenfarbe m it dem P terid in ­gehalt, so läßt sich feststellen, daß einer zunehm en­den V erdunkelung der Augen eine V erm inderung der fluoreszierenden Stoffe entspricht. Auch hierin zeigt sich die Ü bereinstim m ung m it den V erhältnis­sen bei E phestia 9.

a) C harakterisierung d er genotyp isch en U nter­schiede in eindim en sionalen C hrom atogram m en

Die Fluoreszenzintensitäts-V erteilung entlang ein­dim ensionalen C hrom atogram m en stim m t völlig mit den aus den zweidim ensionalen Chrom atogram m en gewonnenen Ergebnissen überein (Abb. 4 ) .

Im 1. Abschnitt zeigen W ild- und ra-Rasse einen viel höheren Gipfel als Stam m 6. Im 2. Abschnitt erhebt sich die ra-K urve außerordentlich hoch über die K urven der beiden anderen Genotypen. Im3. Abschnitt übertrifft Stam m 6 den W ildtyp und die M utante ra. Diese beiden Genotypen gleichen auch in der Intensitätsverteilung der eindim ensio­nalen Chrom atogram m e völlig dem W ildtyp und der a-M utante von E p h es tia 3.

b ) K orre la tion zw ischen 2 -A m in o-6 -h ydroxyp terid in und der e-Substanz

Die Zusam m enstellung der Fluoreszenzwerte von Stam m 6 ließ eine Beziehung zwischen e und2-A m ino-6-hydroxypteridin verm uten, indem häufig der E rhöhung des einen eine Senkung des anderen Flecks entspricht. D iese Beziehung w urde an H and von 26 Chrom atogram m en geprüft und als negative K orre la tion (K orrelationskoeffizient r = —0, 466; t r = 2 ,56* ) bestätigt. Sie ist nach dem J-Test m it

9 A. K ü h n , Naturwissenschaften 4 3 , 25 [1956].

) / l - r*

690 F. F. DE ALMEIDA

Abb. 3. Verteilung und Konzentra­tion (Höhe der Säulen = Galvano- meterwerte) der fluoreszierenden Stoffe in zweidimensionalen Chro­matogrammen für drei Genotypen von Plodia interpunctella. Wildtyp (schwarze Säulen) im Vergleich zu

den Mutanten (weiße Säulen), a mit ra, b mit Stamm 6.

Stämme b ci e Isox. X anth. 2-A-6-hpt. gr g' T

1 71,3 1003,3 264,7 90,8 153,6 60,5 5,4 _ 1649,6(26) (26) (26) (26) (26) (22) (26)

13 92,3 1241.0 1757,4 187.8 519.1 42,2 — — 3839,8(20) (20) (20) (20) (20) (16)

6 13,2 285,4 70,7 54,3 70.3 479,9 — 6,6 980,4(26) (26) (26) (26) (26) (26) (26)

Tab. 2. Durchschnittliche Fluoreszenzintensität (in Galvanometereinheiten) der verschiedenen Flecke für drei Genotypen von Plodia interpunctella aus zweidimensionalen Chromatogrammen. Zahlen in ( ) = Anzahl der gemessenen Flecke.

T = Gesamtfluoreszenz.

P = 0 .0178 als „bedeutsam “ zu betrachten und weist Auch der Vergleich der F luoreszenzintensitäten auf eine stoffliche Beziehung zwischen diesen beiden von e- und k-Substanz bei den drei Genotypen Substanzen hin. (Abb. 3) läßt dieselbe A bhängigkeit erkennen.

NOTIZEN 6 9 1

Abb. 4. Fluorometer-Kurven eindimensionaler Chromato­gramme; m ittlere Meßwerte von je 5 Köpfen der Genotypen ra+, ra und Stamm 6. Abszisse: 2-mm-Abschnitte der Chro­matogrammstreifen. Laufm ittel: Propanol-Ammoniak. Die

Pfeile bezeichnen die Gipfel, welche den verschiedenen Flecken entsprechen.

DiskussionDer W ildtyp und die ro täugige M utante ra von

P lod ia zeigen dasselbe Stoffinventar in derselben quantitativen V erteilung wie die entsprechenden

N O T I

Zur Biosynthese des Coniins

Von U l r i c h S c h ie d t f und H a n s G ü n te r H ö s s

M ax-Planck-Institut für Biochemie, München(Z. Naturforschg. 13 b, 691—692 [1958] ; eingegangen am 12. Ju li 1958)

Die Alkaloide des gefleckten Schierlings ( Conium maculatum) Coniin, A^-Methyl-coniin, y-Conicein, Con- hydrin und Pseudoconhydrin gehören zur Klasse der Piperidinalkaloide. Nach R o b in so n 1 gilt Lysin als Aus­gangssubstanz für die Biogenese dieser Gruppe von Alkaloiden. Um diese Hypothese zu prüfen, haben wir in die Blätter von 13 bis 14 Monate alten Schierlings­pflanzen 2,2 mg uniform markiertes L-Lysin-14C • 2 HCl mit einer Gesamtaktivität von 9,8 * 106 Imp./Min. in­jiziert. Nach drei Tagen wurden die Pflanzen getrocknet und auf Coniin aufgearbeitet. Aus sieben Pflanzen wur­den insgesamt 118 mg racemisches Coniin-hydrochlorid, Schmp. 113,5°, mit einer spezifischen Aktivität von 4,3 • 103 Imp./Min./mMol isoliert. Schmelzpunkt und spezifische Aktivität blieben auch nach mehrmaligem Umkristallisieren aus Aceton konstant. Eine C r a i g -

1 R. R o b in s o n , „The Structural Relations of Natural Pro­ducts“, Oxford University Press, London 1955, p. 64.

Genotypen von Ephestia . Die M utante ra greift an späterer Stelle in die B ildungskette der Ommo- chrome ein als a; ih r genspezifisches Fluoreszenz­m uster ist, wie Parabioseversuche gezeigt h a b e n 2, direkt abhängig vom A usfall der P igm entierung durch Ommochrome. Da die V erm ehrung der fluo­reszierenden Stoffe bei ra vor allem P terid ine be­trifft, haben wir es auch bei dieser M utante m it einem Fall von biochemischer P olyphänie zu tu n 9.

Die außerordentliche V erm ehrung von 2-Amino- 6-hydroxypteridin hat Stam m 6 m it der M utante bch von E phestia gem einsam. Im Gegensatz zu die­ser ist aber Isoxanthopterin nicht reichlicher, son­dern schwächer vorhanden als beim W ildtyp. D am it nähert sich Stam m 6 der M utante r o s y 2 von D roso ­p h ila 10, bei der Isoxanthopterin fehlt und 2-Amino- 6-hydroxypteridin gleichfalls stark angereichert w ird. Ob wie dort die A ktivität der X anthinoxydase betroffen ist, läßt sich noch nicht sagen. Ebenso bleibt noch zu untersuchen, ob der dunklere F arb ­eindruck des Auges m it der w eitgehenden R eduk­tion der gelben cx- und e-Substanz zusam m enhängt.

10 E. H a d o r n u . I. S c h w in c k , Z. Vererbungslehre 87, 5 2 8[ 1 9 5 6 ] .

Z E N

Fraktionen Nr. (r)Abb. 1. Grundprozeß der C r a i g - Verteilung, ra = 18, F = 2 ,0 . System sek. Butanol/W asser, V = 2 ,0 . • ---------- • ex­perimentell gewonnene Kurve; x --------x auf G = 0,76 be­rechnete Kurve. Die spezifischen Aktivitäten der Fraktionen 4, 6, 8, 9, 11 sind in 103 Imp./Min./mMol 4,0; 4 ,5; 4,2; 4,3;

4,5.