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Das Kochbuch.GRUNDWISSEN, REZEPTE UND STRATEGIEN FÜR MIKROBIELLE BIOPROZESSE.

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Einleitung

Nun ist es also soweit.

Endlich stehen Sie im Labor vor einem Bioreaktor und sind hochmotiviert, allerlei Experi-mente mit dem Gerät zu starten.

Apropos starten: Wie schaltet man so einen Bioreaktor überhaupt an? Und dann? Mit einem Blick ins Handbuch kann diese Frage geklärt werden, aber was ist mit der grund-sätzlichen Funktionsweise, zusätzlichen Tipps zur Vorbereitung und zur Durchführung eines Bioprozesses? Womöglich wurde das eine oder andere Experiment schon einmal durchgeführt. Könnte man dieses nicht am Anfang schlichtweg «nachkochen» anstatt sich gleich in neuen Kreationen zu verlieren?

Darüber haben wir uns auch Gedanken gemacht. Schliesslich ist noch kein Bioprozess- Experte vom Himmel gefallen.

Mit diesem Leitfaden möchten wir Ihnen eine Orientierung geben und Sie Schritt für Schritt an den Bioprozess heranführen. Wir erklären, wie ein Bioreaktor funktioniert und was darin passiert, wenn man Mikroorganismen mit Nährstoffen zusammenbringt. Wir schauen uns die Grundlagen des Bioprozesses und die Strategien an, mit denen ein Bio-prozess zum gewünschten Erfolg geführt werden kann. Und wir werfen einen Blick auf die üblichen Beteiligten, die Mikroorganismen. An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, dass dieses Dokument auf Bioreaktoren mit 0,5 L bis 10 L Arbeitsvolumen sowie aerobe, mikrobielle Bioprozesse eingeht, auch wenn einige Erläuterungen durchaus auf grössere oder kleinere Experimente anwendbar sind.

Wie in allen guten Kochbüchern befinden sich in diesem Dokument Rezepte.

Es sind Rezepte, die zur bestmöglichen Kultivierung von Mikroorganismen ausgelegt sind, um jedes Missverständnis hinsichtlich Verwechslungen mit einem konventionellen Koch-buch auszuschliessen. Klare Anleitungen, einen Ausblick auf das zu erwartende Ergebnis und einige Tipps sollen helfen wunschgemäss auch genau dieses Ziel zu erreichen.

Natürlich ist es mit einem kleinen Leitfaden nicht getan. Der Bioprozess an sich ist nur ein Schritt, dem Prozesse vorangehen, die sich mit der Vorbereitung der Mikroorganismen, Kulturmedien, und Korrekturmittel beschäftigen. Und es gibt viele nachgelagerte Proze-duren, bei denen das Ernten und das Weiterverarbeiten des Bioprozess-Ergebnisses im Fokus stehen. Wir hoffen jedoch, dass wir Ihnen mit diesem «Kochbuch» den Schritt in die Bioverfahrenstechnik erleichtern, die Neugierde wecken und die Angst vor vermeint-lich «dummen» Fragen nehmen – die wir uns im Übrigen beim Schreiben selbst gestellt haben.

Wir freuen uns auf Rückmeldungen, die das Kochbuch verbessern und erweitern. Hinwei-se und konstruktive Kritik nehmen wir gerne unter [email protected] entgegen.

Wir wünschen eine angenehme Lektüre!

Inhalt

Einleitung 3

1. Bioreaktor-Grundlagen 5 1.1 Wozu ein Bioreaktor? 5 1.2 Aufbau und Komponenten 5 1.3 Funktionsweise 6

Gerührt oder geschüttelt? 6 Temperaturmessung und -regelung 7 pH-Messung und -Regelung 7 Nährstoffe hinzufügen 8 Begasung 8 Druckmessung und -kontrolle 9 Schaumbildung vermeiden 9

2. Bioprozess-Grundlagen 11 2.1 Mikroorganismen 11 Bakterien 11 Hefe 12 Pilze 12 2.2 Der Bioprozess 12 2.3 Was geschieht nach dem Bioprozess? 15

3. Aufbau, Vorbereitung und Durchführung eines Bioprozesses 19 3.1 Bioreaktor vorbereiten 19 3.2 Nährmedium hinzufügen 22 3.3 Wenn der Spass dann vorüber ist... 23

4. Bioprozessstrategien und deren Steuerung 25 4.1 Batch 25 4.2 Fed-Batch 25 4.3 Kontinuierlicher Kulturbetrieb 26 4.4 Weitere Sonderformen der Prozessführung 26 4.5 Massstabsübertragung bei der Prozess- und Medienentwicklung 27

5. Anwendungsbeispiele 29 5.1 Saccharomyces cerevisiae- Kultivierung 29 5.1.1 Grundaufbau 29 5.1.2 Workflow 29 5.2 Escherichia coli-Kultivierung 33 5.2.1 Grundaufbau 33 5.2.2 Workflow 33 5.3 Pichia pastoris-Kultivierung 38 5.3.1 Grundaufbau 38 5.3.2 Workflow 38

6. Tipps für einen erfolgreichen Bioprozess 45 6.1 Kontaminationen vermeiden 45 6.2 Wachstumsmaximierung durch Messung der Gelöstsauerstoffkonzentration 45 6.3 Kulturvolumen beibehalten 45 6.4 Schaumbildung vermeiden 45 6.5 Funktionsfähiger Abgasfilter 46 6.6 Konstante Pumpengeschwindigkeit 46 6.7 Erfolgreiche Biomasseausbeute 46 6.8 Erfolgreiche Proteinausbeute 46 6.9 Tipps für Fed-Batch-Prozesse 47

7. Weiterführende Literatur 49 7.1 Biotechnologie 49 7.2 Bioprozesstechnik 49 7.3 Mikrobiologie 49 7.4 Praktische Laborarbeit 49 7.5 Populärwissenschaftliche Publikationen 49

8. Glossar 50

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1. Bioreaktor-Grundlagen

1.1 Wozu ein Bioreaktor?

Am Anfang eines jeden Bioprozesses steht eine Idee. Diese kann sein, die Zellen zu vermehren, um sie zur Herstellung von Protei-nen zu verwenden. Oder vielleicht sind gewisse Stoffwechselpro-dukte von Interesse, welche die Mikroben und Mikroorganismen im Laufe des Bioprozesses generieren.

Um diese Idee zu einem Ergebnis zu bringen, benötigt man ein Rezept, die richtigen Zutaten und eine ziemlich gute Küchenma-schine. Sie soll nicht nur rühren, sondern auch die Temperatur und Rührgeschwindigkeit überwachen, die eine oder andere Zutat beimengen und die Umgebung, innerhalb derer das geschehen soll, steril halten. In unserem Fall ist diese Küchenmaschine ein Bioreaktor, genauer gesagt, ein Rührkesselreaktor.

Ein Bioreaktor ist ein multi-tasking-fähiges Gerät, das dem Forscher mittels automatischer Überwachung und Regelung der gewählten Prozessparameter dabei hilft, das gewünschte Bioprozess-Ergebnis zu erlangen. Im Bioreaktor wird eine ideale Umgebung bereitgestellt, in der die Mikroorganismen sich auf das konzentrieren können, was sie tun sollen: sich vermehren.

Ähnlich wie Mitarbeiter im Labor liefern die Mikroorganismen nur konstant gute Arbeit, wenn die Bedingungen stimmen: Es sollte weder zu heiss noch zu kalt sein, sowie ausreichend gutes Essen und frische Luft bereitstehen. Auf den Bioreaktor übertragen bedeutet dies, den pH und die Temperatur konstant zu halten, für genügend Sauerstoff oder andere Gase zu sorgen sowie bei entsprechender Vorab-Konfiguration durch den Anwender ab und zu Nährstoffe hinzuzufügen.

1.2 Aufbau und Komponenten

Angesichts der Fülle an Funktionen, die ein Bioreaktor ausführen muss, stellt sich vielleicht die Frage, wie er dies bewerkstelligen kann. Welche Komponenten benötigt es hierzu? Woher weiss man, welche die aktuell im Bioreaktor vorherrschenden Bedingun-gen sind und wie korrigierend eingegriffen werden kann? Und um nicht vollends den Überblick zu verlieren: wie können die während eines Batches (Bioprozess, siehe Glossar) erfassten Daten sinnvoll angezeigt, strukturiert gesichert und ausgewertet werden?

Die wichtigsten Prozessparameter und die Mechanismen zu deren Regelung werden in Kapitel 1.3 beschrieben. In Kapitel 4 wird detailliert gezeigt, wie ein Bioreaktor zusammengebaut wird. Doch hier soll zunächst ein genereller Überblick über die Techno-logie gegeben werden, die aus zwei wichtigen Systemen besteht, dem Gerät an sich und der SCADA (Supervisory Control and Data Acquisition) Software.

Funktionen des Bioreaktors, z.B. Minifors 2• Low-level-Ansteuerung von Sensoren und Aktoren• PID-Regler (Closed-Loop-Controller)• Kaskaden, d.h. Variation mehrerer Parameter• Bedieneinheit für lokale Eingaben• Je nach Modell: einfache Visualisierung an der Bedieneinheit

Funktionen der SCADA-Software, z.B. eve®

• Zentrale Sammelstelle aller Bioprozessinformationen• Überwachung und Steuerung mehrerer Bioreaktoren• Schnittstelle zu übergeordneten Analysegeräten,

z.B. Massenspektrometern• Planung komplexer Batch-Strategien• Je nach Version: Integration von Design of Experiment (DoE)

und Process Analytical Technology (PAT)

Im Bioreaktor übernimmt ein leistungsstarker Controller die erste Stufe der Prozesskontrolle. Er kommuniziert direkt mit den Sensoren und Aktoren des Bioreaktors. Die Sensoren, z.B. für pH und Temperatur, werden benötigt, um Informationen über den aktuellen Zustand des Systems zu sammeln. Mit Aktoren wie Hei-zelementen, Pumpen oder Ventilen kann der Bioreaktor hingegen, falls nötig, korrigierend eingreifen. Die Digitalisierung macht auch vor der Bioprozesstechnik keinen Halt und eine Vielzahl von Kom-ponenten wird bereits über digitale Bussysteme wie z.B. Modbus angesprochen. Dennoch sind auch analoge Schnittstellen nicht wegzudenken und z.B. für die bewährten Pt100-Temperatursen-soren unabdinglich. Der Controller ist zudem dafür verantwortlich, alle ihm übermittelten Sollwerte präzise einzuhalten. Dazu errech-net er über PID-Regler (proportional-integral-derivative controller) basierend auf den Istwerten aus, welche seiner Aktoren er wie ansteuern muss, um den Sollwert möglichst effektiv und ohne Sprünge einzustellen.

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Zudem verfügt der Bioreaktor über eine lokale Bedieneinheit (auch engl. HMI, Human Machine Interface). Die Bedieneinheit ermöglicht dem Anwender - wie der Name schon andeutet – eine direkte Interaktion mit dem Bioreaktor. Heutzutage handelt es sich bei der Bedieneinheit moderner Bioreaktoren meistens um einen Touchscreen. An der Bedieneinheit kann der Anwender Prozesspa-rameter für einen Batch (Bioprozess, siehe Glossar) anpassen und die Regler ein- und ausschalten oder anderweitig konfigurieren. Zudem kann die Schnittstelle für die Verbindung einer SCADA- Software konfiguriert werden.

Die im Bioreaktor generierten Resultate sollen heutzutage mög-lichst zentral gesammelt und ausgewertet werden. Nur so lassen sich moderne, auf Big Data abzielende Algorithmen effektiv einsetzen, um ein Mehr an Informationen zu generieren und das Prozessverständnis zu verbessern. Diese Aufgabe wird von einer SCADA-Software wahrgenommen. Bei INFORS HT ist dies eve®, die Plattform-Software für Bioprozesse. Über ein lokales oder glo-bales Netzwerk nimmt sie auf Basis standardisierter Protokolle wie OPC UA Kontakt mit den Bioreaktoren auf. In einem ersten Schritt können so bereits ohne grössere Eingriffe des Anwenders alle Daten des Bioreaktors ausgelesen und zentral gespeichert werden, um sie entweder individuell oder zusammen mit Daten anderer Batches vergleichend auszuwerten.

Dabei kommen schnell Ideen für neue Experimente auf, ggf. sogar komplexe Batch-Strategien. Diese können mühelos in eve® geplant werden – sicher komfortabler mit Kaffee im Büro statt im Labor-kittel am Bioreaktor – und später zur Steuerung des Bioreaktors verwendet werden, was im Idealfall sogar vollautomatisch erfolgt. Zudem können auch sämtliche den Batch begleitende Informa-tionen in eve® zentralisiert werden, was Informationen über die verwendeten Mikroorganismen, deren liebstes Kulturmedium oder die Messdaten zu den Proben, die aus dem Bioreaktor entnom-men wurden (offline-Analytik), einschliesst.

Ausserdem integriert eve® auch viele Komponenten des sog. «Bio-reaktor-Umgebung». Dazu gehören Werkzeuge zur Prozessopti-mierung mittels Design of Experiment (DoE) oder leistungsstarke Soft(ware)-Sensoren, mit denen sich zeitgleich und ohne Umwe-ge zusätzliche Informationen aus den Prozessparametern eines Batches errechnen und sogar zur Regelung heranziehen lassen. So kann zum Beispiel der respiratorische Quotient RQ verwendet werden, um eine Abschätzung der Stoffwechselaktivität mittels des Verhältnisses von ausgeschiedenem Kohlenstoffdioxid zu aufgenommenem Sauerstoff zu erhalten.

Gerade wenn Bioreaktor und SCADA-Software perfekt aufeinan-der abgestimmt sind, bieten sich derart viele Möglichkeiten, dass deren Beschreibung den Rahmen dieses Kochbuchs sprengen würde. Falls Sie zu den glücklichen Besitzern der beiden Systeme gehören, haben Sie Mut, es einfach einmal auszuprobieren – Sie

werden sehen, wie spielend leicht Sie von den vielfältigen Features profitieren können. Andernfalls sind Sie herzlich eingeladen durch unsere Webseite zu stöbern, einen Blick in die eve®-Tutorials zu werfen oder eine Demo-Version anzufordern.

1.3 Funktionsweise

Bei einem Rezept weiss der geübte Hobbykoch, welche Behältnisse und Geräte er verwenden muss, um mit den angegebenen Zutaten zu dem erwünschten Ergebnis zu kommen. Ähnlich verhält es sich bei den Bioreaktoren. Der geübte Anwender stellt sich den Reaktor mit den benötigten Komponenten so zusammen, dass die im Rezept angegebenen Bedingungen für die Mikroorganismen mög-lichst dauerhaft erreicht werden. Doch um welche Bedingungen handelt es sich hier? Und wie erreicht man deren präzise Einhal-tung? Genau diese Fragen werden im nächsten Abschnitt geklärt.

Gerührt oder geschüttelt?Die permanente Durchmischung ist wichtig für alle Bioprozesse. Wenn die Nährstoffe im Bioreaktor nicht ausreichend verteilt werden, kommt es im Bioreaktor lokal zu deutlichen Abweichun-gen von den Idealbedingungen. So könnte der pH zu sauer oder die Mikroorganismen nicht ausreichend mit Nährstoffen versorgt sein. Solche Abweichungen mindern nicht nur die Effizienz des geplanten Bioprozesses, sondern können durch den auf die Mik-roorganismen einwirkenden Selektionsstress auch genetische Mo-difikationen fördern, die damit zu einem dauerhaft veränderten und im Regelfall unerwünschten Verhalten der Mikroorganismen führen. Ein weiterer Aspekt ist die Temperaturverteilung. Ohne gleichmässiges Rühren werden die Mikroorganismen am Kessel-rand regelrecht gekocht, während diejenigen in der Mitte kalte Füsse bekommen. Wer sich schon einmal Suppe in der Mikrowelle aufgewärmt hat und sie vor lauter Vorfreude ohne umzurühren gleich verzehrt hat, wird eine ähnliche Erfahrung gemacht haben.

Die typische Rührgeschwindigkeit variiert je nach kultiviertem Organismus. Bei Bakterien, Hefen und Pilzen sind dies in der Regel 500 min–1 bis 1500 min–1, bei Tier-, Pflanzen- und Insektenzellen – die nachfolgend nicht weiter im Detail erläutert werden – 30 min–1 bis 300 min–1. Die Anpassung der Rührgeschwindigkeit ist in Ab-hängigkeit von den zu kultivierenden Zellen zu wählen, da diese unterschiedlich auf Scherstress, also die mechanische Beanspru-chung, welche durch das Rühren verursacht wird, reagieren. Durch die Veränderung der Rührgeschwindigkeit kann auch während des Bioprozesses die Verfügbarkeit von Sauerstoff variiert werden und so ein optimales Wachstum der Zellen zu gewährleisten.

Temperaturmessung und -regelungAlle Mikroorganismen haben Enzyme, die sich in einem bestimm-ten Temperatur- und pH-Bereich am wohlsten fühlen. Wird dieser über- oder unterschritten, wachsen die Zellen nicht so gut, da die Stoffwechselleistungen und das Wachstum zu einem be-trächtlichen Teil von Enzymen, also katalytisch aktiven Proteinen, abhängt. Im schlimmsten Fall werden diese gar durch die Umge-bungsbedingungen zerstört.

Zur Bestimmung der Temperatur wird im Bioreaktor ein Pla-tin-Messwiderstand, ein sogenannter Pt100-Sensor eingesetzt. Dieser hat bei 0 °C einen Widerstand von 100 Ω und kann bei entsprechender Kalibrierung den erwarteten, biologisch relevan-ten Messbereich gut abdecken.

Der Regelbereich liegt zumeist zwischen +5 °C bis +50 °C über der Raumtemperatur, während die typischen Temperaturen, bei denen Bioprozesse betrieben werden, zwischen 20 °C und 50 °C liegen. Soll bei Temperaturen nahe oder unterhalb der Raumtem-peratur gearbeitet werden, ist eine aktive Kühlung, z.B. über einen Umlaufkühler, erforderlich. Für den Grossteil der Bioprozesse soll die Temperatur während der gesamten Kultivierung konstant bleiben. Jedoch gilt für einige Produkte wie etwa Penicillin oder rekombinante Proteine (d.h. biotechnologisch hergestellte Proteine mit Hilfe von gentechnisch veränderten Organismen), dass ein Temperaturwechsel am Ende der Wachstumsphase wichtige Gene zur Produktbildung aktiviert und daher förderlich ist.

Für die Temperaturregelung mittels eines Wärme- und/oder Kühl-kreislaufes gibt es verschiedene Wege: • Elektrischer Heizblock mit eingebauter Kühlspirale (Minifors 2

und Multifors 2)• Heizpolster aus Silikon, das nach der Sterilisation um das Kultur-

gefäss gewickelt wird (Labfors 5)• Doppelmantel, in dem Wasser zirkuliert wird. Die Temperatur

wird über eine elektrische Heizung oder Dampf und ein magne-tisches Ventil zum Einlass von Kühlwasser eingestellt (Labfors 5, Techfors-S und Techfors).

pH-Messung und -RegelungDie Messung und Kontrolle des pH ist bei den meisten Biopro-zessen sehr wichtig, da die Mikroorganismen selbst oft zu einer Änderung dessen beitragen. Kulturmedien für Mikroorganismen beinhalten üblicherweise auch Puffersubstanzen, d.h. Stoffe, die bei Zugabe von Säure oder Base einen allzu drastischen Umschlag des pH abschwächen. Ist dies nicht der Fall, ändert sich der pH oftmals schlagartig, womit sich die Wachstumsbedingungen für die Mikroorganismen massgeblich verändern – mit meist fatalen Folgen. Liegt der pH-Wert ausserhalb des Präferenzbereiches, vermehren sich die Mikroorganismen nicht weiter oder ster-ben gar ab. Eine starke Änderung des pH kann zudem weitere unerwünschte Stoffwechselprozesse hervorrufen und zu einer Hemmung der entsprechenden Mikroben führen. Ein Beispiel da-für ist die Milchsäuregärung, die schon seit der Jungsteinzeit vom Mensch zur Haltbarmachung von Lebensmitteln eingesetzt wird. Damit werden Sauermilchprodukte, Sauergemüse und Sauert-eigbrote produziert, welche durch die Milchsäure-Ausscheidung der entsprechenden Bakterien angesäuert werden. Dies führt im Gegenzug zu einer Wachstumshemmung anderer Mikroor-ganismen ab pH 4,5 und bei weiterem Abfallen des pH zu einer Hemmung der Milchsäurebakterien an sich. Bakterien, Hefen und Pilze benötigen beim Bioprozess in der Regel einen pH zwischen 4,5 und 7,0, Tierzellen um 7,0.

Zur Messung des pH während des Bioprozesses ist jeder Bioreak-tor mit einem pH-Sensor, einer sogenannten pH-Einstabmesskette, ausgerüstet. Damit der Bioreaktor etwaige Abweichungen des pH auch korrigieren kann, werden ihm zudem eine Säure und oder eine Lauge bereitgestellt und über Schläuche und Pumpen mit dem Kulturgefäss verbunden. Je nach Bedarf führen die Pumpen beispielsweise Phosphorsäure, Natronlauge oder Ammoniakwas-ser zu. Die Konzentration der Säure und der Lauge muss hierbei geschickt gewählt werden: ist sie zu hoch, so können die konzen-trierten Säuren- oder Laugentropfen die Mikroorganismen schädi-gen, bevor sie im Bioreaktor verteilt werden. Ist die Konzentration hingegen zu niedrig, muss mehr Volumen der Säure oder Lauge zugegeben werden und das Kulturmedium wird unnötig verdünnt.

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Nährstoffe hinzufügenWährend des Bioprozesses wird in der Regel eine Vielzahl von Nährstoffen von den Mikroorganismen verbraucht. Wenn man den Mikroorganismen alles auf einmal bereitstellt und diese im dann folgenden Bioprozess nicht weiter füttert, nennt man dieses Vorgehen Satzbetrieb oder Batch.

Ein anderer Weg, Nährstoffe nicht zum begrenzenden Faktor wer-den zu lassen, ist die konstante Zufuhr einer Nährlösung während der Kultivierung, welche man folglich Zulauf-Satzbetrieb oder Fed-Batch nennt. Bei guten Wachstumsbedingungen verdoppeln sich die Mikroorganismen stetig und folgen daher einer exponentiellen Wachstumskurve, weshalb die Fütterungsrate idealerweise eben-falls exponentiell erhöht wird, solange der Bioreaktor die anderen Prozessparameter aufrechterhalten kann.

Eine besondere Prozessführung des Fed-Batch ist die kontinuierli-che Kultur, bei der sich ein Fliessgleichgewicht einstellt, ein soge-nannter steady state. Dabei wird zum Beispiel genauso viel frisches Kulturmedium hinzugeführt wird, wie abgeführt wird. Solche Bio-prozesse eignen sich insbesondere dann, wenn ein Überangebot an Nährstoffen eine Hemmung der Mikroorganismen nach sich ziehen würde. In Kapitel 5 des Kochbuchs wird auf die verschiede-nen Feed-Strategien nochmals näher eingegangen.

BegasungIm Bioreaktor werden die Mikroorganismen durch sterile Luft mit Sauerstoff versorgt. Dies geht einher mit einer starken Durch-mischung durch hohe Rührerdrehzahlen (bis zu 2000 min–1). Diese trägt nicht nur zur gleichmässigen Verteilung der Stoffe und Mi-kroorganismen im Bioreaktor bei, sondern zerkleinert zudem die Gasblasen, die im Bioreaktor aufsteigen, wodurch der Sauerstoff effizienter an die Nährlösung abgegeben werden kann. Dies ist wichtig, da nur der in der Nährlösung gelöste Sauerstoff für die Mikroorganismen zur Verfügung steht und über die Zelloberflä-che aufgenommen werden kann. Im Gegenzug gelangt so auch das von den Mikroorganismen gebildete Kohlendioxid wieder in die Gasphase und wird letztlich durch einen Sterilfilter aus dem Kessel abgeführt. Zur Regulierung des pH sowie zur Bereitstellung zusätzlicher Nährstoffe sind am Bioreaktor Pumpen vorhanden, mit denen entsprechende Korrektur- oder angereicherte Nährlö-sungen in das Kulturgefäss dosiert werden können.

Verschiedene Mikroorganismen haben voneinander abweichende Bedürfnisse: aerobe Bakterien benötigen Sauerstoff, während andere mit Gasgemischen wie Synthesegas («Syngas») Vorlieb nehmen. Anaerobe Kollegen können hingegen gänzlich ohne Begasung auskommen und bedienen sich ausschliesslich anorga-nischer und organischer Stoffe aus dem Kulturmedium, wie zum Beispiel Nitrat oder Fumarat.

Zu Beginn des Bioprozesses benötigt eine Kultur z.B. weniger Sau-erstoff, da das Wachstum noch langsam verläuft, später jedoch bei zunehmender Wachstumsgeschwindigkeit wird sehr viel mehr davon notwendig. Der Bioreaktor sorgt nicht nur für die perma-nente Zufuhr des gewünschten Gases oder -gemisches, sondern liefert es auch in der richtigen Menge zum richtigen Zeitpunkt. Hierfür verfügt der Bioreaktor über Gasanschlüsse, die mit der hausseitigen Druckluftleitung, einem Kompressor oder einer Gas-flasche verbunden sind.

Die Begasungsrate wird gewöhnlich in Litern pro Minute gemes-sen. Um eine generische, auf verschiedene Bioreaktoren über-tragbare Grösse geben zu können, wird häufig die spezifische Begasungsrate angegeben, die sich auf Vielfache des Arbeits-volumens bezieht (vessel volumes per minute, vvm) und in L L–1 min–1 bzw. nur min–1 angegeben wird. Ein typischer Wert ist das 1- bis 1.5-fache des Arbeitsvolumens pro Minute, das Maximum liegt typischerweise bei 2 L L min–1. Für einen Bioreaktor mit 4 L Arbeitsvolumen wäre die maximale Begasungsrate somit 4 L * 2 L L min–1 = 8 L min–1.

Doch die Effizienz, mit der der Bioreaktor Sauerstoff in das Kul-turmedium liefert, lässt sich nicht nur durch eine Änderung der Begasungsrate steuern. Je grösser die Oberfläche aller Gasblasen im Bioreaktor ist, das heisst, je feiner zerteilt die Gasbläschen an sich sind, desto effizienter gestaltet sich der Übergang des Sauerstoffs aus der gasförmigen in die flüssige Phase. So kann z.B. die Erhöhung der Rührerdrehzahl zu einer Verbesserung des Sauerstoffeintrags führen, da der Rührer die Gasblasen weiter zer-kleinert und somit die Oberfläche aller Gasblasen im Bioreaktor in der Summe grösser wird. Der Sauerstoffgehalt kann noch weiter gesteigert werden, indem die Luft mit reinem Sauerstoff angerei-chert oder die Begasung gar ausschliesslich mit reinem Sauerstoff durchgeführt wird.

Die genaue Regelung des pO2 und somit die präzise Kontrolle der Begasungsrate und der Gaszusammensetzung sind sehr wichtig, da der pO2 im Normalfall nicht der wachstumsbegrenzende Faktor für die Kultur sein soll. Bei ungenügender Kontrolle kann der pO2 aber zum limitierenden Faktor werden.

Da das dem Bioreaktor zugeführte Gas im Regelfall trocken ist, kann sich bei der Begasung Feuchtigkeit aus dem Bioreaktor im Gas lösen. Bei hoher Begasungsrate würde somit nicht nur der Füllstand sinken, sondern auch der Abgasfilter durch die Feuchtig-keit blockiert, sodass das Abgas nicht mehr entweichen kann und sich Druck aufbauen kann. Um diesen Effekt zu vermeiden, sind Bioreaktoren mit einem effizienten Abgaskühler ausgestattet, in dem die im Abgas gelöste Feuchtigkeit kondensiert und zurück in den Bioreaktor tropfen kann, bevor sie zum Abgasfilter gelangt.

Druckmessung und -kontrolleJe höher der Druck im Kessel ist, desto mehr Sauerstoff löst sich. Kulturgefässe aus Glas sind häufig jedoch nur für einen Druck bis 0.5 bar zugelassen, was nicht mal dem halben Druck eines mo-derat gefüllten Fahrradreifens entspricht. Bei höherem Betriebs-druck können leicht beschädigte Kulturgefässe aus Glas bersten, was nicht nur manchem Forscher den Tag (und das Experiment) ruiniert, sondern auch ein Sicherheitsrisiko darstellt. Daher ist es erforderlich, stets für eine freie, drucklose Abgasstrecke aus dem Bioreaktor zu sorgen, indem beispielsweise der Abgasfilter trocken gehalten und regelmässig ersetzt wird – und natürlich auch, für die Unversehrtheit des Kulturgefässes zu sorgen. Anders als Kulturgefässe aus Glas sind Edelstahl-Bioreaktoren für höhe-re Drücke ausgelegt und bereits in der Standardkonfiguration für einen Überdruck von bis zu 2 bar geeignet (ein gut gefüllter Fahrradreifen). Derartige Systeme werden zudem häufig mit einer Druckregelung ausgerüstet, die basierend auf einem Drucksensor im Bioreaktor und einem Proportionalventil in der Abgasstrecke den Druck im Bioreaktor nicht nur messen, sondern auch aktiv regeln können.

Schaum vermeidenSchaum gehört ausserhalb von Badewannen und Biergläsern zu den eher unbeliebten Begleiterscheinungen, vor allem in Bioreak-toren. Er entsteht an der Grenzfläche der Flüssigkeit zur Gasphase im Kulturgefäss und kann schnell seinen Weg hoch bis unter den Deckel finden. Im schlimmsten Fall verstopft er dann die Abgasfil-ter, was wiederum den Gasfluss blockiert. Daher sind die meisten Bioreaktoren mit einem System zur Bekämpfung der Schaumbil-dung ausgerüstet. Mechanische Schaumstörer im Kopfraum sind eher grossen Edelstahlbioreaktoren vorbehalten, während auf chemischen Mitteln basierende Antischaum-Kontrollsysteme (z.B. PPG, Struktol oder silikonbasierte Entschäumer) auch in kleineren Bioreaktoren zu finden sind.

Ein typisches Antischaum-Kontrollsystem besteht aus einem Sensor, der auf einer bestimmten Höhe im Kulturgefäss ange-bracht wird. Falls die Schaumhöhe den Sensor erreicht, wird ein Antischaum-Mittel aus einer Vorratsflasche in das Kulturgefäss gepumpt. Diese Antischaum-Mittel sind an der Grenzfläche von Flüssigkeit und Gas aktiv und steigern die Neigung der Schaum-blasen, in sich zusammenzufallen. In besonders hartnäckigen Fäl-len löst sich der Schaum nicht sofort auf, dann wird die Prozedur nach einer vorab eingestellten Zeit wiederholt («shot & delay»-Ak-tion). Bei der Verwendung des Antischaum-Mittels ist Vorsicht geboten, da schon eine minimale Überdosierung sich wie eine zweite Haut auf die Oberfläche der Flüssigkeit legen kann, was den Gasaustausch behindert. Ebenso wirken Antischaum-Mittel einem effizienten Sauerstoffeintrag entgegen, da sie aufgrund der hervorgerufenen Änderung der Oberflächenspannung ein Zusam-menfallen der Gasblasen im Bioreaktor fördern und somit die für den Gasaustausch zur Verfügung stehende Oberfläche reduzieren. Die Auswahl des geeigneten Mittels hängt auch von den kultivier-ten Mikroorganismen ab, da Bakterien und Zellen unterschiedlich auf gewissen Chemikalien reagieren.

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2. Bioprozess-Grundlagen

Um zu verstehen, welche Bedingungen ein Bioreaktor für ein optimales Wachstum der Mikroorganismen bereitstellen muss, ist es wichtig zu wissen, in welcher naturgegebenen Umgebung sich die Organismen wohlfühlen und was sie zu ihrem Wachsen und Gedei-hen benötigen.

Je nachdem, welche Kohlenstoff-und Energiequellen genutzt werden und wo die soge-nannten Elektronen herkommen, können die Organismen in eine Vielzahl von Klassen eingeteilt werden. Wer genaueres über den Stoffwechsel von Mikroorganismen erfahren möchte, findet ausführliche Informationen in den Klassikern der Biochemie-Literatur (s. Kapitel 7).

Im Glossar (Kapitel 8) werden unter den Stichpunkten «photoroph», «chemotroph», «au-totroph» sowie «heterotroph» die verschiedenen Arten der Energiegewinnung erläutert.

2.1 Mikroorganismen

Praktisch alle anzüchtbaren Organismen pro- und eukaryotischen Ursprungs (d.h. mit oder ohne Zellkern) können in einem Bioreaktor kultiviert werden. Dafür muss eine Vor-kultur, das sogenannte Inokulum, hergestellt werden, welches wiederum 5 bis 10 % des Gesamtvolumens des zu beimpfenden Mediums ausmacht. Das Inokulum wird zumeist als Schüttelkultur und maximal in zwei Schritten produziert, während der eigentliche Biopro-zess typischerweise in einem Bioreaktor abläuft.

Hier nun eine kleine Zusammenfassung der bekanntesten Organismen, mit denen mikro-bielle Bioprozesse unternommen werden:

BakterienSie decken ein weites Spektrum an möglichen Wachstumsbedingungen ab, sind so-zusagen das Schweizer Taschenmesser der Mikroorganismen. Neben den «normalen» Bakterien gibt es auch Anhänger der extremen Umweltbedingungen, sog. Extremophile (lat. -phil = liebend/affin). Beispiele sind thermophile (mögen hohe Temperaturen) oder halophile (mögen hohe Salzkonzentrationen) Mikroorganismen.

Die Verdopplungszeit, also die Zeit, die es braucht, bis sich eine Mikroorganismenpopu-lation verdoppelt hat, kann zwischen Minuten und Tagen variieren, was wiederum davon abhängt, ob es sich um anaerobe oder gar genveränderte Bakterien handelt.

Typische Kultivierungsparameter von Bakterien im Schüttler und Bioreaktor:

Parameter Temperatur Durchmischung Kultivierungsdauer pH pO2

Schüttler 20–60 °C 100– 400 min–1 8–60 h

Bioreaktor 20–60 °C 100–1500 min–1 8–60 h 7,0 0–80 %

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HefeHefe hat die gleichen grundlegenden Anforderungen bezüglich Durchmischung, Tempe-ratur etc. wie Bakterien. Deshalb benötigen diese in der Regel keine speziellen Wachs-tumsbedingungen, da typischerweise eine Prozesstemperatur um 30 °C und ein saurer pH bevorzugt wird. Eine gute Durchmischung sowie ausreichende Versorgung mit Sauerstoff sind das A und O für eine gute Ausbeute an Hefe-Biomasse. Um der starken Wärmeentwicklung durch den Hefemetabolismus entgegenzuwirken und eine akzep-table Betriebstemperatur einzuhalten, ist unter Umständen eine Kühlung des Prozesses notwendig.

Typische Kultivierungsparameter von Hefen im Schüttler und Bioreaktor:


Schüttler 25–30 °C 200–250 min–1 16 h

Bioreaktor 25 °C 1000 min–1 16–48 h 6,5 40–50 %

PilzeSie wachsen häufig als mycelartige, faserige Zellverbunde, die vergleichsweise scher-empfindlich sind. Daher neigen sie dazu, sich an der Gefässwand oder gar im Kopfraum festzusetzen, um so dem Scherstress zu entkommen. Dem gegenüber steht das aufgrund der faserigen Zellverbunde sehr viskose Kulturmedium, für dessen Durchmischung und Begasung ein hoher Leistungseintrag nötig ist. Daher ist es oft knifflig, ideale Betriebspa-rameter für die Kultivierung von Pilzen zu identifizieren.

Ein typischer Bioprozess zur Erzeugung von Zitronensäure im industriellen Massstab wird heutzutage mit Aspergillus niger, einem Fadenpilz, durchgeführt. Bei hohem Glucose- und Sauerstoffgehalt des Mediums, gleichzeitig sehr niedrigem pH und geringer Eisen-konzentration wird Zitronensäure in grossen Mengen ausgeschieden.

Typische Kultivierungsparameter von Pilzen im Schüttler und Bioreaktor:


Schüttler 23 °C 250 min–1 72 – 90 h

Bioreaktor 23 °C 1500 min–1 8 – 72 h 5,0 – 6,0 25 – 50 %

2.2 Der Bioprozess

Ein Bioprozess zielt darauf ab, mithilfe von Zellen oder deren Bestandteilen mehr von ei-nem «Produkt» mit einem zusätzlichen Nutzen zu generieren. Dies kann Biomasse an sich sein oder lediglich Bestandteile der Zellen, die man im Nachgang, manchmal mühevoll, aufarbeitet.

Enzyme, also Stoffe, die durch ihre Struktur als Katalysatoren für chemische Reaktionen dienen können, wurden früher als Ferment bezeichnet. Daher kommt der für den Bio-prozess fälschlicherweise synonym verwendete Begriff Fermentation, welcher im ur-sprünglichen Sinne lediglich «Gärung» bedeutet. Schon Louis Pasteur erfasste mit seinem Ausdruck «Fermentation, c’est la vie sans l’air» goldrichtig, dass es sich bei einer Fermen-tation (= Gärung) um eine biotische Reaktion unter Ausschluss von Luft handelt. In der

neueren Definition handelt es sich um einen Abbau organischer Stoffe, bei dem es sich als terminalen Elektronenakzeptor zur Energiegewinnung nicht um molekularen Sauerstoff handelt. Streng genommen ist aus diesem Grund die Essigsäuregärung keine Gärung im Sinne der neueren Definition, während die Produktion von Ethanol und Milchsäure sowie einige weitere Gärungsformen definitiv darunter zu zählen sind.

Als Beispiel für Bioprozesse in unserem Alltag können exemplarisch die Käseherstellung, die Erzeugung von Biogas, das Betreiben von Bioreaktoren jeglicher Art sowie die Pro-duktion rekombinanter Proteine und Biosimilars herangezogen werden, was beispielhaft die Bereiche der Lebensmitteltechnologie, Landwirtschaft, biomedizinischen Forschung und pharmazeutischen Produktion abdeckt. Natürlich gibt es noch ein Unmenge weiterer Bioprozesse, die dem grossen Feld der Biotechnologie zuzuordnen sind.

Durch die Auswahl der richtigen Prozessstrategie kann der Bioprozess optimal ausgelegt und ein Maximum an Produkt- und Zeiteffizienz erreicht werden. Auch kann an der best-möglichen Medienzusammensetzung und dem Funktionieren der Mikroorganismen zum Beispiel durch gezielte genetische Manipulation geschraubt werden. Diese vorbereiteten-den Schritte werden zusammen mit dem eigentlichen Bioprozess Upstream Processing genannt.

Nach dem Animpfen einer Kultur in den Bioreaktor, der sogenannten Inokulation, müssen sich die Mikroorganismen erstmals an die neuen Umgebungsbedingungen anpassen. Diesen Zeitraum nennt man Latenz- oder Lag-Phase.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Lag-PhaseDas dem Kulturmedium hinzugesetzte Inokulum definiert die Startmenge an Zellen. Nach der Inokulation des Bioreaktors steigt die Lebendzellzahl nur langsam an, da die Organismen sich noch an die herrschenden Umgebungsbedingungen gewöhnen müssen. Diese Phase nennt man daher Latenz- oder Lag-Phase.

Zeit

Inokulum

Lag-Phase

log

(Le

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Obwohl ausreichend Nährstoffe und vor allem keine metabolischen Abfallprodukte im frischen Medium vorhanden sind, können die Mikroorganismen noch nicht mit Höchst-geschwindigkeit wachsen, da sie nicht optimal an die Umgebung angepasst sind. Dies geschieht durch Erfühlen der Umgebungsparameter wie Temperatur und Nährstoffan-gebot zur Heraufregulierung der passenden Gene, welches je nach Organismus einige Zeit in Anspruch nehmen kann. Die Lag-Phase kann verkürzt werden, indem man z.B. im Schüttelkolben eine Vorkultur unter denselben Bedingungen (gleiches Medium, gleiche Temperatur) ansetzt und die Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase rasch in den Bioreaktor überführt.

In der sich daran anschliessenden exponentiellen Phase, im Englischen auch Log-Pha-se genannt, ist der Mikroorganismus bestens auf die Umgebung angepasst und die Wachstumsrate der teilungsfähigen Zellen ist maximal. Die Bezeichnung «exponentielles Wachstum» rührt daher, dass sich die Anzahl der Zellen nicht bloss auf lineare Weise vergrössert, sondern sich verdoppelt. Das heisst, es entstehen nicht nur 2, 3, 4, 5 Zellen, sondern 4, 8, 16, 32 Zellen usw.

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Generell teilen sich die Zellen mit maximal möglicher Geschwindigkeit und damit wächst die Biomasse. Nun werden die Nährstoffe mit maximaler Rate aufgenommen und ver-stoffwechselt, was im Fall eines aeroben Bioprozesses zu einem erhöhten Sauerstoffbe-darf und einem erhöhten Ausstoss an Kohlenstoffdioxid führt. Kurz gesagt, die Nähr-stoffe werden aufgebraucht. Während dieses Prozesses produzieren die Bakterien auch Nebenprodukte wie z.B. organische Säuren oder überschüssige Wärme. Für diese muss mit dem breiten Instrumentarium des Bioreaktors Abhilfe geschafft werden, damit das Zellwachstum davon nicht beeinträchtigt wird. In der Log-Phase steigt durch die zuneh-mende Menge an Biomasse der Gehalt an freien Proteinen im Medium das Risiko der Schaumbildung.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Log-PhaseDie nun gut angepassten Zellen teilen sich mit höchst-möglicher Geschwindigkeit, da sie alle nötigen Nährstoffe vorfinden. Aus diesem Grund nimmt die Zahl lebender Zellen rapide zu und man nennt dieses Phase auch exponentielle oder Log-Phase.

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Das exponentielle Wachstum kann leider nicht ewig dauern. Nährstoffe erschöpfen sich, Bestandteile schon toter Zellen sammeln sich an, kurzum im Bioreaktor sieht es immer mehr aus wie bei Hempels unterm Sofa.

Es wird immer ungemütlicher im Bioreaktor und so nimmt die Wachstumsrate in der sich anschliessenden stationären Phase weiter ab. Jedoch halten sich in dieser Phase die Ver-mehrung und das Absterben der Mikroorganismen gerade noch in Waage.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der stationären PhaseDurch sich erschöpfende Nährstoffe und die Ansammlung schädlicher Abbauprodukte nimmt die Teilungsrate der Mikroorganismen soweit ab, dass die Zahl absterbender Organismen zur Anzahl durch Teilung hinzukommender Organismen etwa gleich ist. Daher nennt man diese Phase auch stationäre Phase.

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Am Ende des Bioprozesses, in der sogenannten Absterbephase, fällt die Wachstumsrate soweit ab, dass mehr Mikroorganismen absterben als durch Teilungsprozesse hinzukom-men, netto also ein Verlust an Mikroorganismen zu beklagen ist. Je nach Prozessführung kommt es also im Bioprozess zu einem «natürlichen Ende» oder dem gezielten Abbruch des Bioprozesses durch den Nutzer.

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Absterbe-PhaseWenn der Bioprozess bis in die Absterbe-Phase fortschreiten darf, so ist diese Phase von einer abnehmenden Zahl lebender Mikroorganismen durch zu wenig verfügbare Nährstoffe und die Ansammlung schädlicher Nebenprodukte gekennzeichnet. Da mehr Mikroorganismen absterben als durch Teilung hinzu-kommen, nimmt die Zahl lebender Organismen ab.

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Log-Phase Lag-Phase Absterbe-Phase

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Dies hängt auch davon ab, wie lange ein solcher Prozess wirtschaftlich sinnvoll zu betrei-ben ist. Würde der Bioprozess nicht aktiv beendet, so setzt ein allmähliches Absterben der Zellen ein, weil schlichtweg die Nahrung aufgebraucht ist und die toxische Wirkung sich akkumulierender Stoffwechselprodukte ihr Übriges tut.

2.3 Was geschieht nach dem Bioprozess?

Nach der Beendigung des Bioprozesses erfolgt im Regelfall die Ernte und Aufarbeitung der gewünschten Produkte, was auch als Downstream-Processing bezeichnet wird. Je nach Prozess und dem angestrebten Endprodukt kann sich daher stark unterscheiden, welche Fraktion nach einem Bioprozess behalten und weiter verarbeitet wird.

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Upstream-ProzessUSP

inklusive Bioprozess

Downstream-ProzessDSP

Abbildung 5: Einbettung des Bioprozesses in die BioverfahrenstechnikObwohl der Bioprozess schon an sich eine komplexe Angelegenheit darstellt, kann im Vor- und Nachlauf noch viel optimiert werden. So gehört zur Bioprozessentwicklung auch die Verbesse-rung des Erzeugerstammes, des Mediums und der Zusätze sowie der Feeds als der Möglichkeiten (Upstream-Prozess), wie das Produkt im Nachgang möglichst schonend, mit hoher Reinheit und guter Ausbeute aufgearbeitet wird (Downstream-Prozess).

Zum Beispiel kann lediglich die Biomasse oder das Medium geerntet und entsprechend aufbereitet, um das gewünschte Produkt zu erhalten. Abhängig von den Eigenschaften des Produktes gestaltet sich die Aufreinigung simpel oder aufwändiger und involviert entsprechend mehr oder weniger kostspielige Prozeduren.

So kann beispielsweise ein rekombinantes Protein, welches von dem Mikroorganismus ins Medium abgegeben wird, kann durch schlichte Aufarbeitung des Mediums gewonnen werden, während ein ähnliches Protein, welches allerdings nicht sekretiert werden kann, erst mühevoll aus der Zelle und damit aus der komplexen Mixtur von Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren und Zuckern aufgereinigt werden muss. Generell folgt das Downstre-am-Processing den Arbeitsgängen Zellabtrennung, Zellaufschluss bei intrazellulär vorlie-gendem Produkt, Produktgewinnung und -konzentrierung, -reinigung sowie -konfekti-onierung. Parallel dazu verläuft natürlich die Säuberung und erneute Vorbereitung des Bioreaktors für den nächsten Prozess mittels manueller Reinigung und Sterilisation, CIP und/oder SIP.

Notizen

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3. Aufbau, Vorbereitung und Durchführung eines Bioprozesses

3.1 Bioreaktor vorbereiten

Für diejenigen, die nach den bisherigen Ausführungen immer noch oder erst recht motiviert sind, einen Bioprozess zu starten, sind nachfolgend die einzelnen Schritte aufgeführt, die für den erfolgreichen Betrieb des Bioreaktors notwendig sind. Dies soll dabei als kurze Zusammenfassung der benötigten Schritte dienen. Für eine detailliertere Beschreibung der Vorgehensweise steht die Handbücher der Bioreaktoren mit Rat und Tat zur Seite, z. B. Kapi-tel 8 «Vor der Kultivierung» im Handbuch des Minifors 2.

1. Kulturgefäss vorbereitenBevor es ans Eingemachte gehen kann, ist zunächst das Wichtigs-te zu überprüfen: das Kulturgefäss an sich. Es soll schliesslich in den folgenden Stunden und Tagen als sicheres Zuhause für unsere Mikroorganismen dienen. Daher muss überprüft werden, dass das Kulturgefäss an sich unbeschädigt ist und alle O-Ringe sitzen und intakt sind – sonst können nach dem Autoklavieren Kontaminati-onen eindringen und den Prozess stören. Aus eben diesem Grund ist unabdingbar, dass alle für den Prozess benötigten Sensoren, Eingänge für Gase und Korrekturmittel sowie Stutzen für die Probenahme oder Zellernte eingebaut, verschlaucht und gesichert sind. Ist der Reaktor erst einmal autoklaviert, können Änderungen nur noch vorsichtig unter einer Sterilwerkbank erfolgen, wobei es jedoch immer ein Restrisiko für eine Kontamination gibt.

Für die Kontrolle des Kulturgefässes ist es nicht unüblich, dass selbiges in seine Einzelteile zerlegt wird oder nach der Reinigung als Abschluss des vorhergehenden Prozesses noch als einzelne Baugruppen vorliegt. Das korrekte Montieren des Kulturgefässes wird also schnell zur Routine – und der Neid auf Anwender von immer grösser. Doch hier nun die wichtigsten Punkte, auf die zu achten ist:

• Einbauhöhe und festen Halt Rührelemente auf der Welle prüfen, ggf. Schrauben lösen, verschieben und wieder fest-ziehen

• Je nach geplantem Prozess, Schikanenkorb einsetzen

Hinweis: In manchen Bioreak-toren wie dem Labfors 5 liegen die Schikanen nicht als Schika-nenkorb vor, sondern werden am Deckel befestigt.

• O-Ring für die Deckeldich-tung auf Beschädigungen und korrekten Sitz prüfen

• O-Ringe an allen Deckelein-bauten, egal, ob Einlässe, Sensoren oder Blindstopfen, prüfen

Am Inokulationsport wird anstelle des O-Rings eine Silikonmembran eingesetzt, die später zum Animpfen über eine Kanüle oder eine optio-nale Anstechnadel verwen-det werden kann. Da diese Membran bei jedem Prozess durchstochen wird, sollte sie regelmässig ersetzt werden.

Hinweis: Die Einbauten haben teilweise etwas Spiel. Die einge-setzten O-Ringe dichten jedoch korrekt ab, sodass keine Gefahr für den Prozess ausgeht.

• Einbauhöhe aller höhenver-stellbaren Einbauten wie Sparger oder Tauchrohre prüfen und korrekten Sitz sicherstellen

• Gegebenenfalls Kulturmedium einfüllen

Hinweis: Dies ist nur sinnvoll bzw. möglich, wenn das Kulturmedi-um hitzestabil ist und das Autoklavieren unbeschadet übersteht. Andernfalls muss das Kulturmedium separat sterilisiert und im Anschluss an das Autoklavieren des Kulturgefässes steril in das Kulturgefäss überführt werden.

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• Deckel vorsichtig und korrekt ausgerichtet aufsetzen. Dabei unbedingt beachten, dass sich Einbauteile und Schikanen nicht berühren.

• Rändelschrauben von Hand (kein Werkzeug) und über Kreuz festziehen

2. Sensoren kalibrieren (Teil 1) und einbauenNachdem alle mechanischen Einbauten fixiert sind und der Deckel geschlossen ist, klaffen noch die offenen Ports für die Sensoren. Da diese empfindlich sein können, werden sie typischerweise zuletzt eingebaut. Darüber hinaus müssen die Sensoren vor dem Prozess kalibriert werden. Hierfür gibt es häufig spezifische Ar-beitsanweisungen in den Labors, die sich in Details unterscheiden. Generell erfolgt jedoch die Kalibrierung der pH-Sensoren vor dem Einbau und vor dem Autoklavieren analog zur Kalibrierung ge-wöhnlicher pH-Meter mit zwei Referenzpuffern. Die Kalibrierung der pO

2- und der optionalen Trübungs-Sensoren erfolgt hingegen erst nach dem Autoklavieren und nach dem Einfüllen des Kultur-mediums, da beide Parameter von den tatsächlichen Betriebsbe-dingungen abhängen.

Hinweise: • Werden digitale Sensoren verwendet, so sei zudem erwähnt,

dass diese ihre Kalibrierdaten im Sensorkopf ablegen und transportieren können. Daher müssen diese Sensoren nicht zwangsweise an der Bedieneinheit des Bioreaktors kalibriert werden und die Kalibrierung kann alternativ in einem separaten Kalibrierlabor durchgeführt werden. Die letzte Kalibrierung steht nach Anschluss an den Bioreaktor automatisch zur Verfügung.

• Werden anstelle von optischen pO2-Sensoren amperometrische pO2-Sensoren verwendet, so müssen diese gemäss der Angaben des Sensorherstellers gepflegt werden, worauf in diesem Cook-book nicht eingegangen wird.

• Bei besonderen Anwendungen können zudem weitere Sensoren zum Einsatz kommenz.B. für das Redox-Potential oder die Leitfä-higkeit auf die im Rahmen dieses Cookbooks nicht eingegangen wird.

Arbeitsschritte:• pO2-Sensor in Bioreaktor einbauen• Optional: Trübungssensor in Bioreaktor einbauen• pH-Sensor an Grundgerät anschliessen, Kalibrierfunktion auf der

Bedieneinheit aufrufen und pH-Sensor gemäss der Anweisungen auf der Bedieneinheit kalibrieren (siehe auch Bioreaktorhandbuch).

• pH-Sensor von Grundgerät trennen und in Bioreaktor einbauen• Hinweis: die Anschlüsse digitaler Sensoren keinesfalls mit Alufo-

lie abdecken! Anweisungen des Sensorherstellers beachten!

3. Schläuche anbringen und Autoklavieren vorbereiten

• Korrekturmittelflaschen vorbereiten

Hinweis: Nicht alle Korrektur-mittel können im Autoklaven sterilisiert werden. Anstelle derartiger Korrekturmittel (z. B. Ammoniaklösung) Was-ser einfüllen und nach dem Autoklavieren z. B. unter einer Sterilwerkbank durch eine zweite, mit dem ggf. sterilfiltrier-ten Korrekturmittel tauschen.

• Schlauchpumpenkopftragplat-te von Grundgerät lösen und an Kesselhalter anbringen

• Schlauchverbindungen von Korrekturmittelflaschen zu den Pumpenköpfen und weiter zu den Eingängen auf dem De-ckel herstellen und sichern

• Super Safe Sampler an Probenahmerohr anschliessen, abklem-men und mit Alufolie abdecken

• Luftfilter anschliessen

• Ggf. weitere zusätzliche Schläu-che, z. B. für die Zellernte, anschliessen und abklemmen

• Filter leicht abdecken. Abgasfilter bleibt offen und darf kei-nesfalls abgeklemmt werden! Dies ist für den Druckausgleich während des Autoklavierens unabdingbar!

4. AutoklavierenVorbereitetes Kulturgefäss in Kulturgefässhalter samt angeschlos-sener Peripherie wie Korrekturmittelflaschen gemäss lokaler Arbeitsanweisungen autoklavieren, z. B. bei 121 °C für 20 bis 30 Minuten.

5. Sensoren kalibrieren (Teil 2) und Kulturgefässhalter mit Grundgerät verbindenDas Kulturgefäss ist nun nahezu breit für den Bioprozess. Es muss nur noch mit dem Grundgerät verbunden werden, ggf. ist das Kul-turmedium einzufüllen und die Kalibrierung der letzten Sensoren ist durchführen.

Arbeitsschritte:

• Kulturgefässhalter am Grund-gerät positionieren

Hinweis: Je nach Ausführung des Bioreaktors sind zudem Schläu-che für die Temperierung via Doppelmantel zu verbinden oder die Heizmatte zu montieren. Bitte jeweiliges Handbuch beachten!

• Pumpenkopftragplatte auf Antriebsschäfte aufstecken

• Korrekturmittelschläuche befüllen

Hinweis: Werden die Schläuche nicht mit Korrekturmittel befüllt, kann es zu Fehlverhalten der Regler kommen, da diese zunächst anstelle von Korrekturmittel nur die Luft aus den Schläuchen in das Kulturgefäss fördern

• Schaum-, pH-, pO2- und Tr-übungssensor anschliessen

Hinweis: Werden anstelle von optischen pO2-Sensoren amperometrische pO2-Sensoren verwendet, so müssen diese gemäss der Angaben des Sen-sorherstellers polarisiert werden, worauf hier nicht weiter nicht eingegangen wird.

• Temperatursensor in Tauchrohr einführen

• Motor aufstecken

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• Begasung und Abgaskühler anschliessen

• Falls nicht im Kulturgefäss mit autoklaviert: Kulturmedium steril einfüllen

• Bioreaktor starten und Rührwerk sowie Temperierung mit den gewünschten Sollwerten einschalten

• Sobald die Sollwerte erreicht sind: ggf. pH-Sensor nachjustieren oder pH des Kulturmediums einstellen, pO2-Sensor kalibrieren und Nullpunktabgleich für Trübungssensor durchführen

6. Inokulieren und (endlich) richtig loslegenJetzt ist alles für Inokulation, die Zugabe der Mikroorganismen bereit. Wie so häufig Biotechnologie-Leben hängt das genaue Vorgehen wieder vom individuellen Fall ab. Wer sich nur an die Welt der Bioreaktoren herantasten oder sehr einfache Fragestel-lungen beantworten möchte, gibt tatsächlich lediglich die Zellen zu, signalisiert dies dem Bioreaktor oder der SCADA-Software, und schaut im Anschluss zu, wie sich der Prozess entwickelt. Meis-tens hat man jedoch etwas ganz bestimmtes vor, kennt schon ein wenig das Wachstumsverhalten der Mikroorganismen und möchte z.B. eine ideale Strategie für die Fed-Batch-Phase ermitteln. Diese hat man bestmöglich vorbereitet und idealerweise automatisiert, z. B. mit eve®. Dabei spielt es fast keine Rolle, ob es sich um einfache Strategien wie eine Rampe für den pH oder komplexe, von errechneten Faktoren wie Substrataufnahmeraten abhängige Strategien handelt – denn wer möchte schon die ganze Zeit am Reaktor warten, nur um zum richtigen Zeitpunkt die Sollwerte anzupassen. Auf die Planung und Vorbereitung solcher Strategien wird hier nicht näher eingegangen, doch können die Beispiele in Kapitel 6 sicherlich als Inspiration dienen.

Arbeitsschritte:• Ggf. «Nullprobe» von noch zellfreiem Kulturmedium nehmen• Zellen für Inokulation vorbereiten, z. B. aus Vorkultur im Inkuba-

tionsschüttler, und in geeignetes Gefäss zur Inokulation geben. Eine vergleichsweise einfache Methode für ein Inokulum bis 25 mL bzw. 50 ml kann z.B. eine Spritze mit einer Kanüle sein, mit welcher die Membran im Animpfstutzen durchstochen wird, um die Zellen in das Kulturmedium zu geben. Hierbei kann es helfen,

die Membran z.B. mit einer Alkohollösung zu desinfizieren oder in der Nähe einer Flamme zu arbeiten, doch eine hundertprozen-tige Sicherheit gibt es nicht.

Hinweis: Keinesfalls sollte Desinfektionsmittel auf die Membran gegeben werden! Bereits ein kleiner Tropfen davon, der beispiels-weise beim Anstechen in das Kulturmedium gelangen kann, kann ausreichen, um das ganze Experiment zu ruinieren!

• Über den Knopf am Bioreaktor oder in der SCADA-Software sig-nalisieren, dass inokuliert wurde, und hierdurch z.B. den Ablauf der hinterlegten Strategie starten

3.2 Nährmedium hinzufügen

Bisher wurde viel Zeit damit verbracht, den Bioreaktor überhaupt zum Laufen zu bringen. Es wurde angeschlossen, geschraubt, hin-zugefügt und unter Dampf sterilisiert und der idealtypische Ablauf eines Bioprozesses betrachtet. Aber wachsen nun die Kulturen erwartungsgemäss? Wie bei vielen Dingen im Leben heisst es auch hier: Kommt darauf an.

Zum Beispiel auf die Nährstoffe, die wir den Mikroorganismen im Medium zur Verfügung stellen. Davon braucht es im Regelfall eine grosse Vielfalt, da die Mikroorganismen alles im Medium vorfin-den müssen, um sich selbst aufzubauen und so zu vermehren. Manchmal sehen die Medienrezepte verblüffend einfach aus, weil nur sehr wenige Komponenten aufgeführt sind. Doch handelt es sich dann meist um Komplexmedien, in denen «komplexe» Bestandteile wie Hefeextrakt oder Pepton verwendet werden, welche wiederum eine erhebliches Spektrum einzelner Nährstoffe enthalten, um all die Elemente bereit zu stellen, aus denen eine Zelle besteht. Im Gegensatz dazu gibt es definierte Medien, bei denen die einzelnen Nährstoffe präzise eingewogen und selbst gemischt werden. In einer Unterkategorie davon, den Minimalme-dien, ist dann nur noch genau das enthalten, was die Mikroorga-nismen wirklich im Bioprozess benötigen. Dies ist insbesondere im Hinblick auf die Kostenoptimierung und die Vermeidung uner-wünschter Nebenreaktionen von Bedeutung.

Im Gegensatz zum Minimalmedium wird ein sogenanntes Selek-tivmedium verwendet, um gezielt eine bestimmte Art Mikroorga-nismus durch die geschickte Wahl der Umgebungsparameter zu kultivieren. Dies kann sowohl durch eine clevere Wahl der Nähr-stoffe als auch durch Zugabe von Stoffen wie Antibiotika, die das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen hemmen, erfolgen. Nährmedien lassen sich noch nach vielen weiteren Gesichtspunk-ten unterscheiden, was allerdings den hier vorhandenen Rahmen sprengen würde.

Was die Nährstoffe angeht, so sind ganz besonders Verbindun-gen mit den Elementen Kohlenstoff, Sauerstoff und Stickstoff als Makronährstoffe (C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe) von Bedeutung. Zudem werden in geringeren Mengen auch die sogenannten Mik-ronährstoffe und Spurenelemente benötigt wie zum Beispiel Kup-fer, Molybdän, Vitamine oder Aminosäuren. Als Kohlenstoffquelle kommen Zucker oder Zuckeralkohole (z.B. Glucose, Glycerin), Stärke aus Mais oder Kartoffeln, aber auch Sirup aus Zuckerrohr oder Zuckerrüben sowie Zelluloseabfälle in Frage.

Als Lieferant für Stickstoff und eine Vielzahl von Begleitstoffen werden oft Extrakte aus Hefe, Soja oder Kasein sowie deren mit Verdauungsenzym (Pepsin und Trypsin) behandelte Pendants, sogenannte Peptone und Tryptone, verwendet. In definierten Medien können stattdessen beispielsweise Ammoniumsalze zum Einsatz kommen.

Nachfolgend findet sich ein generisches Rezept für Nährmedien, welches mittels der Komponenten von TB-Medium für die Bakteri-enkultivierung und YPD-Medium für die Hefekultivierung genauer erklärt wird:

Komponenten typischer Konzentrationsbereich

Beispiel bakterielle Kultivierung TB-Medium

Beispiel HefekultivierungYPD-Medium

Wasserstoffakzeptor 50–100 % Sauerstoff Sauerstoff

Kohlenstoffquelle 1–20 g l–1 Peptide* Glucose

Stickstoffquelle 0.2–2 g l–1 Peptide* Peptide*

anorg. Nährstoffe (S, P etc.) 50 mg l–1 Schwefel*, Magnesium* Schwefel*, Magnesium*

Spurenelemente 0.1–1 µg l–1 Salze* Salze*

Wachstumsfaktoren wie AS,Purine, Vitamine

0.1–1 mg l–1 z.B. Vitamin B* z.B. Vitamin B*

Lösungsmittel Wasser Wasser

Pufferkomponenten KH2PO4–K2HPO4 n.v.

* Komponenten stammen aus komplexen Medienbestandteilen wie Pepton oder Hefeextrakt

Die zwei rechten Spalten führen jeweils am Beispiel eines bakteri-ellen und eines Hefekulturmediums die Zusammensetzung auf. Da beides Komplexmedien sind, kann oftmals die genaue Menge der einzelnen Stoffe nicht genau beziffert werden und deren Herkunft lediglich auf das Pepton und den Hefeextrakt zurückgeführt wer-den kann. Typischerweise werden Medienzusammensetzungen so gewählt, dass bis auf einen Bestandteil ein leichter Über-schuss vorhanden ist. Dieser eine Bestandteil, der das Wachstum begrenzt, wird limitierender Faktor genannt. Üblicherweise wird hierfür die Kohlenstoffquelle gewählt.

Für die Praxis bleibt noch wichtig zu erwähnen, dass die Koh-lenstoffquelle (und unter Umständen weitere Komponenten wie zum Beispiel Kaliumphosphatpuffer) separat zu autoklavieren und später steril hinzuzugeben sind. Dies verhindert, dass unter der

Hitzeeinwirkung des Autoklavierens reduzierende Zucker mit der nukleophilen Gruppe der Aminosäuren neue Verbindungen (siehe Glossar: Maillardreaktion) eingehen. Das riecht dann zwar erfreuli-cherweise so lecker, als hätte man etwas gebacken oder gebraten, reduziert aber unnötigerweise die Menge an verfügbarem Zucker und Aminosäuren für die Mikroorganismen.

Generell ist wichtig, im Auge zu behalten, dass die vorgestellten Medien nur zwei aus einer Vielzahl von Nährmedien für verschie-denste Anforderungen sind. Veränderungen dieser Grundrezepte lassen stets eine Anpassung an individuelle Bedürfnisse zu. Daher sei an dieser Stelle auf den Beispielcharakter der verwendeten Or-ganismen und Prozessparameter inklusive Nährmedium verwiesen.

3.3 Wenn der Spass dann vorüber ist…

…muss auch wieder aufgeräumt werden. Das heisst, nach dem erfolgten Bioprozess den Bioreaktor so zurechtzumachen, dass die Mikroorganismen unschädlich gemacht und den Bioreaktor wieder in einen sauberen und gebrauchsfähigen Zustand versetzt ist. Je nach Institution variieren hier die Vorschriften, wie die Organismen abzutöten sind. Entweder geschieht dies durch Autoklavieren im Kulturgefäss und anschliessende Entsorgung der Brühe, was meist ein aufwändigeres Putzen des Kessels und der Peripherie nach sich zieht. Andersherum kann die Kulturbrühe inklusive Mikroorgansi-men auch separat abgetötet werden und der Bioreaktor sowie die Peripherie an den in Kontakt gekommenen Flächen dekontami-niert und anschliessend gesäubert werden.

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4. Bioprozessstrategien und deren Steuerung

Viel Vorbereitung wurde nun in unseren Bioprozess gesteckt und dennoch erfordert es weitere Vorüberlegungen. Gut geplant ist schon halb gewonnen. Dazu sind noch ein paar Grundkenntnisse rund um das mikrobielle Wachstum nötig, damit dann letztlich der Bioprozess in der Umsetzung so abläuft, wie das idealerweise vorausgeplant wurde. Auch hier gilt wieder, das Design folgt den Anforderungen, weshalb man sicher wissen sollte, was das Ziel des Bioprozesses sein soll.

Generell gilt, dass das Wachstum der Mikroorganismen begrenzt wird, sobald ein essenzieller Faktor limitierend wird. Ist zum Beispiel einzig nicht genügend Sauerstoff vorhanden und die Wachstums-rate daher begrenzt, so wird sie wieder zunehmen, wenn aufgrund geänderter Prozessführung mehr Sauerstoff bereitgestellt wird, bis erneut der gleiche (oder ein anderer) Faktor begrenzend wirkt.

4.1 Batch

Wenn man den Mikroorganismen alles Futter mit einem Mal bereitstellt und diese im dann folgenden Bioprozess nicht weiter gefüttert werden, nennt man das Satzverfahren oder Batch. Während des gesamten Bioprozesses kommen keine weiteren Nährstoffe hinzu, es handelt sich um ein geschlossenes System. Lediglich Hilfsstoffe wie Gase, Säure und Laugen werden hinzudo-siert. Der Bioprozess dauert dann so lange, bis die Nährstoffe auf-gebraucht sind. Diese Strategie eignet sich für schnelle Experimen-te wie z.B. die Stammcharakterisierung oder die Optimierung des Nährmediums. Der Nachteil dieser bequemen Methode ist, dass die Biomasse- und Produkt-Ausbeuten begrenzt sind. Da üblicher-weise die Kohlenstoffquelle und/oder der Sauerstoffeintrag recht schnell den limitierenden Faktor darstellen, befinden sich die Mik-roorganismen nicht lang in der exponentiellen Wachstumsphase.

Um die Verfügbarkeit von Gelöstsauerstoff zu verbessern, muss die Sauerstoff-Transferrate erhöht werden. Dies gelingt durch Erhöhung der Rührgeschwindigkeit, des Gasflusses, des Sauer-stoffanteils im Gasmix oder des Druckes, sofern der Bioprozess in einem Stahlbioreaktor erfolgt. Da die Kombination der verschiede-nen Parameter eine Verbesserung der Konzentration herbeiführen soll, braucht es in diesem Fall ausgeklügelte Steuerungs- und Regelprozesse. Diese sogenannten Kaskaden sind frei konfigu-rierbar und werden anwendungsspezifisch eingestellt. Hierbei werden dem Controller ein oder mehrere Parameter, mit denen die Gellöstsauerstoffkonzentration beeinflusst werden können, vorgegeben. Dazu wird der erste Parameter im definierten Bereich variiert, um den Sollwert zu erreichen. Ist dies nicht möglich, werden nachgeschaltete Parameter verändert, bis der Sollwert eingehalten werden kann.

Nach Ende eines im Batch betriebenen Bioprozesses wird dann lediglich die Biomasse oder das Medium geerntet und entspre-

chend aufbereitet, um das gewünschte Produkt zu erhalten. Aus Reaktorsicht ist der Prozess immer wieder durch Reinigungs- und Sterilisationsschritte unterbrochen, Biomasse wird nur in Etappen produziert. Im Batchprozess ist neben der geringen Ausbeute an Biomasse auch das Auftreten einer Substrat- oder Produktinhibie-rung ein grosses Risiko. Letzteres beschreibt die Beeinträchtigung der Enzymtätigkeit durch die Anwesenheit von hohen Konzentra-tionen an Substrat oder Produkt, die eine Stoffwechselrückkopp-lung bewirken, und daher die Ausbeute drastisch senken können.

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Abbildung 6: Schematische Veranschaulichung der Zusammen-hänge von Lebendzellkonzentration, Gelöstsauerstoff sowie der limitierenden Kohlenstoffquelle im Batch-BetriebAnfänglich nimmt die Lebendzellzahl in der Lag-Phase nur langsam zu, was zu einer moderaten, aber steten Abnahme der Kohlenstoffquel-le führt. Der Sauerstoffverbrauch kann während der exponentiellen Wachstumsphase zunehmen, bis dieser den möglichen Sauerstoffeintrag übersteigt. Beim Erschöpfen der Kohlenstoffquelle startet die stationäre Phase, die von einer Absterbe-Phase abgelöst wird, während welcher die Lebendzellzahl drastisch abnimmt.

4.2 Fed-Batch

Ein anderer Weg, Nährstoffe nicht zum begrenzenden Fak-tor werden zu lassen, ist deren konstante Zufuhr während der Kultivierung. Dies nennt man folglich Zulauf-Satzverfahren oder Fed-Batch, wobei es sich um ein teiloffenes System handelt. Das Füttern während der Kultivierung hat den Vorteil, dass insgesamt höhere Produktmengen erreichbar sind.

Bei guten Wachstumsbedingungen verdoppeln sich die Mikroor-ganismen stetig und folgen daher einer exponentiellen Wachs-tumskurve, weshalb ebenso exponentiell ansteigend zugefüttert werden sollte. Generell gelangt die Nährlösung mit Hilfe einer Pumpe aus der Vorratsflasche durch einen Silikonschlauch in das Kulturgefäss. Die Menge kann jederzeit manuell durch den Anwender bestimmt werden (konstant, exponentiell, pulsweise), aber auch aktionsbasierte Dosierungen sind möglich wie zum Beispiel bei Erreichen einer bestimmten Biomassekonzentration

26 27

oder beim Aufbrauchen eines Nährstoffes. Das Verfahren bietet eine grosse Bandbreite an Kontrollstrategien und ist auch für hochspezialisierte Anwendungen geeignet. Demgegenüber ste-hen eine längere Prozessdauer und potentielle Inhibierung durch Akkumulierung toxischer Nebenprodukte. Ausserdem sind für die Durchführung vertiefte Kenntnisse über Bioprozesse notwendig, was hier allerdings nicht als Nachteil ausgelegt werden soll.

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Abbildung 7: Schematische Veranschaulichung des Zusammen-hangs zwischen Lebendzellkonzentration, Gelöstsauerstoff und der limitierenden Kohlenstoffquelle im Fed-Batch-VerfahrenBei der Verfahrensführung im Fed-Batch setzt direkt nach der exponentiel-len Phase die Zuführung des Feeds ein, wodurch sich die Kohlenstoffquelle nicht bzw. nur kurz erschöpft (grüne, dicke Linie vs. grüne, gestrichelte Linie im Batch). Dargestellt ist ein exponentieller Feed, sodass die weiterhin exponentiell wachsenden Organismen in einer verlängerten exponentiellen Phase verbleiben (grüne, dicke Linie vs. graue, gestrichelte Linie im Batch). Dadurch nimmt auch die Menge des konsumierten Sauerstoffs zu, weshalb im Medium ein geringerer Gehalt an gelöstem Sauerstoff zu verzeichnen ist (blaue, dicke Linie vs. blaue, gestrichelte Linie im Batch). Im Beispiel ist die Wachstumsrate µ in der Feedphase geringer gewählt als µmax.

Während das Batch-Verfahren den diskontinuierlichen Prozessen zugeordnet wird, handelt es sich bei Fed-Batch-Verfahren um semi-kontinuierliche Prozesse.

Bei Versuchen zu Beginn des vergangenen Jahrhunderts, mög-lichst viel Biomasse der Bäckerhefe im Batch-Verfahren herzustel-len, stellte sich heraus, dass zu hohe Substratkonzentrationen (in diesem Fall Glucose) eine Wachstumshemmung nach sich ziehen, vornehmlich durch die Bildung von Ethanol. Aus diesem Grund wird hier auf das Fed-Batch-Verfahren zurückgegriffen. Dazu wer-den kontinuierlich verhältnismässig geringe Mengen an Glucose zugeführt, welche alsbald von den Mikroorganismen aufgefuttert werden. Umgekehrt kann man diese Eigenschaft der Bäckerhefe zur Erzeugung von Ethanol ausnutzen. Bei hoher Glucose-Kon-zentration und ausreichend gelöstem Sauerstoff im Medium wird dennoch eine alkoholische Gärung betrieben, was als Crabtree-Ef-fekt bezeichnet wird. Diesen Effekt macht man sich bei einigen Prozessen der Lebensmittelerzeugung mit Hefe zu Nutze.

Fed-Batch-Verfahren an sich haben aufgrund ihrer Vorzüge Einzug in sämtliche Bereiche der biotechnologischen Produktion gehal-ten, insbesondere zur Erzeugung rekombinanter Proteine und Antibiotika.

4.3 Kontinuierlicher Kulturbetrieb

Eine besondere Reaktionsführung, bei der das System offen betrieben wird, ist je nach Bioprozesserfordernis so abgewandelt, dass sich ein Fliessgleichgewicht hinsichtlich einer bestimmten Komponente einstellt (auch steady state genannt). Dabei wird zum Beispiel genauso viel frisches Kulturmedium hinzugeführt wie abgeführt (Chemostat). Solche Bioprozesse werden auch als kontinuierliche Kultur bezeichnet und eignen sich insbesondere, wenn ein Zuviel an Nährstoffen ein Überfressen der Mikroorganis-men und damit eine Hemmung der Mikroorganismen nach sich ziehen würde. Weitere Vorteile dieser Methode sind eine gerin-gere Produktinhibierung und eine verbesserte Raum-Zeit-Aus-beute. Beim Abführen des Mediums werden natürlich auch Zellen ausgetragen, weshalb die Zu- und Abflussraten geringer ausfallen müssen als die Verdopplungszeit der Mikroorganismen. Alternativ können die Zellen auf unterschiedlichste Weise (zum Beispiel in ei-nem Spinfilter) zurückgehalten werden, was als Perfusionsbetrieb bezeichnet wird.

Im kontinuierlichen Prozess kann im Vergleich zum Fed-Batch-Pro-zess nochmals die Raum-Zeit-Ausbeute des Reaktors verbessert werden. Jedoch steigt dabei auch das Risiko für Kontaminationen und langfristige Veränderungen der Kulturen aufgrund der langen Kultivierungsdauer. Ebenso sind kontinuierliche Prozesse ideale Werkzeuge, um ein besseres Prozessverständnis zu erlangen, da bei korrektem Betrieb alle Prozessparameter konstant sind.

4.4 Weitere Sonderformen der Prozessführung

Letztlich finden sich noch Mischformen, die beim Betrieb eines Bioprozesses angewandt werden können. Zum Beispiel kann ein abgeschlossener (Fed-)Batch nur bis auf einen kleinen Rest geern-tet werden, um die verbleibende Zellmenge als Inokulum für die nächste Füllung zu nutzen. Diese Prozessführung nennt man dann repeated (Fed-)Batch-Verfahren. Die Unterscheidung zwischen Batch und Fed-Batch-Prozess erfolgt wiederum nur daran, ob mit dem Überbleibsel des Bioprozesses ein Batch oder Fed-Batch-Ver-fahren unternommen wird. Damit entfällt die Reinigungszeiten des Reaktors sowie die Notwendigkeit zur Anzucht eines frischen Inokulums bei gleichzeitiger Erhöhung der Produktivität. Es geht aber auch, wie bei anderen Fed-Batch-Verfahren, mit einer höhe-ren Kontaminationsgefahr sowie der Möglichkeit der Stammverän-derung einher.

4.5 Massstabsübertragung bei der Prozess- und Medienentwicklung

Zur Prozessentwicklung und -charakterisierung wird typischer-weise mit einem Bioreaktor im Labormassstab begonnen, um dort möglichst viele Parameter zu erfassen und die Limiten des Prozesses kennenzulernen. Gleichzeitig kann so der Bioprozess optimiert, die Zellen und das Medium verbessert als auch kritische Prozessparameter bestimmt werden.

Bei der Auslegung des Bioprozesses für grössere Kulturgefässe, insbesondere um diesen wirtschaftlicher zu machen, wird dann sukzessive auf einen Pilot- und anschliessend gegebenenfalls einen Produktionsmassstab gewechselt. Diese Massstabsübertra-gung nennt man auch Scale-Up. Für die Erzeugung wertintensiver rekombinanter Proteine ist oftmals auch ein Bioreaktor im Labor- oder Pilotmassstab ausreichend.

Der inverse Prozess des Scale-Up wird Scale-Down genannt und eignet sich zur Simulation von Modellversuchen, insbesondere um Fehlfunktionen einer grosstechnischen Anlage zu erklären oder um einen bestehendend Prozess weiter zu optimieren.

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5. Anwendungsbeispiele

Im folgenden Kapitel sollen praxisnahe Anwendungsbeispiele für aerobe, mikrobielle Bioprozesse vorgestellt werden. Wie es sich für ein Kochbuch gehört, finden sich hier anfängergerechte Anleitungen zum einfachen Nachkochen. Dies beinhaltet nicht nur die Rezepte für die Medien, sondern auch die genauen Bedingungen und Mengen sowie, welcher Strategie gefolgt wird. Zudem finden sich am Ende des jeweiligen Bioprozesses noch Hinweise, um Rezept zu verfeinern, indem zum Beispiel mehr Phasen der Fütterung eingefügt werden oder andere Grundrezepte für Medien herangezogen werden. Alle auf-geführten Rezepte sind auch in eve®, der Plattform-Software für Bioprozesse, zu finden.

Den Beginn macht die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, deren Biomasse wir in einem Batch-Verfahren heranzüchten wollen.

Als zweites folgt ein Vorschlag zur Fed-Batch-Kultivierung von Escherichia coli, welches häufig als prokaryotisches Expressionssystem zur Produktion von Proteinen eingesetzt wird.

Zu guter Letzt wird noch die Methanol-verwertende Hefe Pichia pastoris für den Einsatz in einem Hochzelldichte-Fed-Batch-Verfahren auf zwei Substraten vorgestellt, welches als eukaryotisches Expressionssystem für rekombinante Proteine komplexerer Struktur eingesetzt werden kann.

5.1 Saccharomyces cerevisiae-Kultivierung

5.1.1 Grundaufbau

Name Anzucht von Backhefe (Saccharomyces cerevisiae)

Beschreibung Zur Einführung in die Bioprozesstechnik wird ein Bioprozess zur Erzeugung von Hefebiomasse durchgeführt. Dies dient dem Kennlernen der einzelnen Komponenten eines Bioreaktors, des Handlings sowie der grundlegenden Prozesssteuerung in einem Batch-Bioprozess.

Rezept in eve® S. cerevisiae cultivation

Geräteauswahl A und B Inkubationsschüttler, C Bioreaktor

Parameter siehe separate Beschreibung für A, B und C

5.1.2 Workflow

t>12 h t>24 h

VorkulturA

InokulumB

Batch-Kultur im Minifors 2C

t>8 h t>16 h

VorkulturA

InokulumB


t>8 h t>16 h

VorkulturA

InokulumB

Fed-Batch-Kultur (mehrphasig) im Minifors 2C

pO2

aus BioreaktorenBatch

Feed 4.5 ml h–1

Feed

Zugabeschema

50 % Glucose 0,5 l

Fed-Batch 1

t>2 h

Feed 9.0 ml h–1

Fed-Batch 2

t>2 h

Feed 13.5 ml h–1

Fed-Batch 3

ta>2 h

Ende

pO2


Feed 4.5 ml h–1

Feed

Zugabeschema

50 % Glucose 0,5 l

Fed-Batch 1

t>2 h t>2 h t>2 h

Feed 9.0 ml h–1Fed-Batch 2

Feed 13.5 ml h–1Fed-Batch 3 Ende

C1Batchkein FeedBiomasse

C2Fed-BatchGly-FeedBiomasse

C3Fed-BatchMeOH-FeedInduktion

C4Fed-BatchMeOH-FeedProduktion

30 31

A Vorkultur im Inkubationsschüttler

Organismus

Name A Vorkultur

Beschreibung Erzeugung eines reinen S. cerevisiae-Inokulums für die weitere Expansion in Schüttelkultur

Organismus Saccharomyces cerevisiae (Backhefe)

Herkunft aus dem Supermarkt (erhältlich als Würfel aus der Kühltheke oder als Trockenhefe, einige Krümel ins Medium bröseln) oder z.B. Laborwildtypstämme S288c (bzw. FY1679), W303 und CEN.PK2 (10 bis 100 µl von der Erhaltungskultur nutzen)

Inokulumvolumen 10 ml YPD-Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben ohne Strömungsbrecher

zu erreichende Biomasse

abhängig von der zugesetzten Hefemenge

Kulturmedium

Typ Komplexmedium

Name YPD (Yeast extract-peptone-dextrose)

Zusammensetzung 10 g l–1 Hefeextrakt (Y)20 g l–1 Pepton (P)20 g l–1 Dextrose (D)

Kultivierungsparameter

Schüttelhub 25 mm

Schütteldrehzahl 300 min–1

Temperatur 30 °C

Zeit min. 12 h Kultivierungsdauer

B Herstellung des Inokulums im Inkubationsschüttler

Organismus

Name B Inokulum

Beschreibung Erzeugung eines ausreichenden S. cerevisiae Inokulums für die anschliessende Kultivierung im Bioreaktor


Herkunft 10 ml Vorkultur (Schritt A)

Inokulumvolumen 5 ml Vorkultur in 100 ml frischem YPD-Medium, aufgeteilt auf 2 1000 ml Erlenmeyerkolben mit Strömungsbrechern


6–8 g l–1

Kulturmedium

Typ Komplexmedium




Schüttelhub 25 mm


Temperatur 30 °C

Zeit 24 h

C Hauptkultur im Bioreaktor

Organismus

Name C Hauptkultur im Bioreaktor

Beschreibung Biomasseerzeugung mit einer S. cerevisiae Kultur mittels Minifors 2


Herkunft aus Inokulum (Schritt B)

Inokulumvolumen 10 ml YPD-Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben ohne Strömungsbrecher


6–8 g l–1, je nach Stamm und Begasung der Kultur aus Schritt B

32 33

Kulturmedium

Typ Komplexmedium




Temperatur 30 °C

Rührerdrehzahl 1200 min–1

pH 5,5

Begasungsrate 2 min–1 (vvm)

Überdruck 0 bar

pO2 ≥ 20 %

Weitere zu regelnde Parameter am Bioreaktor oder in eve®

Pumpe Zugabe Ziel Stoffangabe Auslöser

a Base pH-Regelung 25 % NH4OH aktionsbasiert

b Säure pH-Regelung 20 % H3PO4 aktionsbasiert

c Antischaum Antischaummittel Biospumex 153 aktionsbasiert

Vorschläge zur Modifikation dieses RezeptesDer Einfachheit halber wurde in diesem ersten Versuch auf die Programmierung einer pO2-Kaskade verzichtet. Alle darauf einwirkenden Parameter wurden auf die entsprechen-den Maximalwerte gesetzt, um einen höchstmöglichen pO2 zu gewährleisten, sodass die maximale Ausbeute an Biomasse möglich wird.

Zur Steigerung der Biomasseausbeute kann die Batch-Phase um drei einfache Fed-Batch-Phasen erweitert werden. Dies geschieht durch die Zufuhr benötigter Nährstoffe in einer so genannten Feedlösung. In den drei aufeinanderfolgenden Phasen steigt die Feedrate um jeweils 1 % an. Das Ende der Batchphase ist durch das Aufbrauchen der Nährstof-fe markiert, weshalb nun weniger Sauerstoff benötigt wird und dementsprechend der Gelöstsauerstoffgehalt im Medium sprunghaft wieder ansteigt. Ab diesem Punkt erfolgt dann die Feedzugabe manuell dosiert nach folgendem Schema oder kann in eve® unter Batch-Strategie als Funktion programmiert werden:

t>12 h t>24 h

VorkulturA

InokulumB


t>8 h t>16 h

VorkulturA

InokulumB


t>8 h t>16 h

VorkulturA

InokulumB


pO2


Feed 4.5 ml h–1

Feed

Zugabeschema

50 % Glucose 0,5 l

Fed-Batch 1

t>2 h

Feed 9.0 ml h–1

Fed-Batch 2

t>2 h

Feed 13.5 ml h–1

Fed-Batch 3

ta>2 h

Ende

pO2


Feed 4.5 ml h–1

Feed

Zugabeschema

50 % Glucose 0,5 l

Fed-Batch 1

t>2 h t>2 h t>2 h







Um die Biomasseausbeutung und die Laufzeit des Bioprozesses weiter zu steigern, des Bioprozesses kann das Medium mit weiteren Komponenten, die sich im Kultivierungsver-lauf schnell erschöpfen (wie z.B. Magnesium), sukzessive versorgt werden. Alternativ kann auch ein reichhaltigeres Grundmedium wie YUM oder BMGY für den Start des Batches verwendet werden.

5.2 Escherichia coli-Kultivierung

Escherichia coli gilt seit jeher als das Arbeitspferd der Molekularbiologie aufgrund der kurzen Generationszeit und der gut handhabbaren Kultivierungsanforderungen und Werkzeuge. Deshalb wird es häufig zur Produktion rekombinanter Proteine eingesetzt. Damit deren Ausbeute möglichst hoch ist, muss eine möglichst grosse Menge an E. coli Biomasse erzeugt werden. Dazu proportional verhält sich die Produktion rekombinanter Proteine in Abhängigkeit des verwendeten Promotorkonstrukts.

5.2.1 Grundaufbau

Name Vermehrung von E. coli

Beschreibung Mit dem vorgeschlagenen dreistufigen Prozess können E. coli nach entsprechender genetischer Veränderung gezielt vermehrt und zur Proteinproduktion eingesetzt werden. Alternativ kann dieser Bioprozess auch zweistufig geführt werden, indem im ersten Schritt schon ein 20 ml Inokulum produziert wird, welches direkt zum Inokulieren des Bioreaktors genutzt wird.

Rezept in eve® Escherichia coli cultivation

Geräteauswahl A und B Inkubationsschüttler C Bioreaktor


5.2.2 Workflow

t>12 h t>24 h

VorkulturA

InokulumB


t>8 h t>16 h

VorkulturA

InokulumB


t>8 h t>16 h

VorkulturA

InokulumB


pO2


Feed 4.5 ml h–1

Feed

Zugabeschema

50 % Glucose 0,5 l

Fed-Batch 1

t>2 h

Feed 9.0 ml h–1

Fed-Batch 2

t>2 h

Feed 13.5 ml h–1

Fed-Batch 3

ta>2 h

Ende

pO2


Feed 4.5 ml h–1

Feed

Zugabeschema

50 % Glucose 0,5 l

Fed-Batch 1

t>2 h t>2 h t>2 h







34 35


Organismus

Name A Vorkultur

Beschreibung Erzeugung eines reinen E. coli Inokulums für die weitere Expansion als Schüttelkultur

Organismus Escherichia coli wie Stamm K-12, BL21, DH5α etc.

Herkunft 10–100 µl einer Flüssigkultur

Inokulumvolumen 10 ml YPD-Medium in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mit Strömungsbrechern


abhängig von der zugesetzten Menge an E. coli

Kulturmedium

Typ Komplexmedium

Name TB-Medium (Terrific broth-Medium)

Zusammensetzung 24,00 g l–1

12,00 g l–1

12,54 g l–1

2,31 g l–1

20,00 g l–1

HefeextraktSoja-PeptonK2HPO4K2HPO4Glycerin (wasserfrei)


Schüttelhub 25 mm


Temperatur 37 °C

Zeit 8 h


Organismus

Name B Herstellung des Inokulums

Beschreibung Erzeugung eines ausreichenden E.coli- Inokulums für die anschliessende Kultivierung im Bioreaktor

Organismus Escherichia coli

Herkunft aus 10 ml Vorkultur (Schritt A)

Inokulumvolumen 10 ml Vorkultur in 100 ml frischem PAN-Medium in 1000 ml Erlenmeyerkolben mit Strömungsbrechern


2,5 bis 10 g l–1 Zelltrockenmasse

Kulturmedium

Typ Komplexmedium

Name PAN-Medium (oder alternativ TB wie im vorhergehenden Schritt)

ZusammensetzungPAN-Medium, pH 7.0

1,6 g l–1

3,2 g l–1

2,6 g l–1

0,2 g l–1

2,0 g l–1

0,6 g l–1

0,2 g l–1

5 g l–1

NaH2PO4 · H2OKH2PO4K2HPO4NH4Cl(NH4)2SO4MgSO4CaCl2 x H2OGlycerin

vorab autoklavieren

ZusammensetzungSpurenelement-Lösung

5 ml l–1

6 g l–1

0,08 g l–1

3 g l–1

0,3 g l–1

0,02 g l–1

0,5 g l–1

20 g l–1

65 g l–1

H2SO4 (conc.)CuSO4 · 5H2OKI,MnSO4 · H2ONa2MoO4H3BO3CoCl2ZnCl2FeSO4 · 7H2O

1,0 ml sterile Spuren element-Lösung je l PAN-Medium hinzufügen


Schüttelhub 25 mm


Temperatur 37 °C

Zeit 16 h

36 37


Organismus

Name C Hauptkultur im Bioreaktor

Beschreibung E. coli-Biomasseerzeugung während der Batch-Phase mittels Minifors 2 und anschliessende Erzeugung von rekombinantem Protein in der Glucosefütterungsphase

Organismus Escherichia coli

Herkunft aus Inokulum-Kultur (Schritt B)

Inokulumvolumen 100 ml Inokulum in 1000 ml frischem PAN-Medium mit Spuren-elementen im 2,5 l Rührkessel mit 2 Impellern, Minifors 2


10 bis 100 g l–1 Zelltrockenmasse

Kulturmedium

Typ Komplexmedium

Name PAN-Medium (oder alternativ TB wie im vorhergehenden Schritt)

ZusammensetzungPAN-Medium, pH 7.0

1,6 g l–1

3,2 g l–1

2,6 g l–1

0,2 g l–1

2,0 g l–1

0,6 g l–1

0,2 g l–1

5 g l–1

NaH2PO4 · H2OKH2PO4K2HPO4NH4Cl(NH4)2SO4MgSO4CaCl2 · H2OGlycerin

im Bioreaktor sterilisieren

ZusammensetzungSpurenelement-Lösung

5 ml l–1

6 g l–1

0,08 g l–1

3 g l–1

0,3 g l–1

0,02 g l–1

0,5 g l–1

20 g l–1

65 g l–1

H2SO4 (conc.)CuSO4 · 5H2OKI,MnSO4 · H2ONa2MoO4H3BO3CoCl2ZnCl2FeSO4 · 7H2O

1,0 ml sterile Spuren element-Lösung je l PAN-Medium hinzufügen


Temperatur 37 °C


pH 5,0

pO2 >20 %

pO2-Kaskade am Touchscreen des BioreaktorsParameter Beschreibung Sollwert zu regelnder Wert

min.zu regelnder Wert max.

1 Rührerdrehzahl 500 min–1 500 min–1 1200 min–1

2 Begasungsrate 1,0 vvm 1,0 vvm vvm

3 Überdruck 0 bar 0 bar 0 bar

4 pO2 ≥ 20 %

Feed-SchemaPhase Beschreibung Ziel Start Ende Aktion proz. Feedrate Feedrate ml/h

C1 Batch 0 h 10 h kein Feed

C2 Fed-Batch 10 h 12 h Glucose 1 % 4,5 ml h–1



C5 Fed-Batch 18 h Glucose 4 % 18,0 ml h–1



Weitere zu regelnde Parameter am Bioreaktor (a,b,c) oder in eve® (d, auch manuell möglich)Pumpe Zugabe Ziel Stoffangabe Auslöser




d Glucose-Feed Kohlenstoffquelle (C)500 g l–1 Glucose

50 % Glucose nach Batch-Phase

38 39

5.3 Pichia pastoris-Kultivierung

Als Hefe mit dem Potenzial Methanol, einen günstigen Ausgangsstoff, zu verstoffwech-seln, sind Bioprozesse mit Pichia pastoris zur Erzeugung rekombinanter Proteine nicht mehr wegzudenken. Die Verwertung von Methanol ermöglicht, die Produktion von Biomasse von der Produktbildung zu entkoppeln und somit durch die Fütterung von Methanol gezielt die Phase der Produktbildung einzuleiten.

Pichia als eukaroytischer Organismus ist zudem in der Lage, Proteine mit ausgeprägten posttranslationalen Modifikationen korrekt gefaltet zu produzieren und ins Medium zu abzugeben, was einen weiteren Vorteil gegenüber der Produktion im E. coli-System dar-stellt. Hinzu kommt, dass Pichia den GRAS-Status (generally recognized as safe – allge-mein als sicher anerkannt) innehat und weder Endotoxinverunreinigungen des Produktes noch bakterielle oder virale Kontaminationsprobleme zu erwarten sind.

Aus Gründen der Konsistenz und der vielfachen Verwendung im Feld wird im weiteren Verlauf der (alte) Name Pichia pastoris in diesem Dokument beibehalten. Eine Reklassi-fizierung machte es notwendig, diese Hefeart der Gattung Komagataella zuzuordnen, weshalb der korrekte Name Komagataella pastoris lautet. Die weiterführende moleku-larbiologische Untersuchung von mitochondrialer RNA wiederum ergab, dass es sich bei den ursprünglich als Pichia pastoris vertriebenen Stämmen eigentlich Komagataella phaffii handelt.

5.3.1 GrundaufbauName Anzucht einer methylotrophen Hefe (Pichia pastoris)

Beschreibung Dieser Modellorganismus wird häufig zur Erzeugung rekom-binanter Proteine verwendet. Zum einen soll der Ablauf eines Fed-Batch-Bioprozesses für einen Hochzelldichte-Bioprozess vorgestellt werden. Zum anderen soll das Verständnis für die Besonderheit der Kultivierung dieser methylotrophen Hefe auf Glycerin und Methanol aufgezeigt werden und wie diese als Phasen im Bioprozess umgesetzt werden sollen.

Rezept in eve® P. pastoris cultivation (fed batch)

Geräteauswahl A und B Inkubationsschüttler C Bioreaktor


5.3.2 Workflow

t>12 h t>24 h

VorkulturA

InokulumB


t>8 h t>16 h

VorkulturA

InokulumB


t>8 h t>16 h

VorkulturA

InokulumB


pO2


Feed 4.5 ml h–1

Feed

Zugabeschema

50 % Glucose 0,5 l

Fed-Batch 1

t>2 h

Feed 9.0 ml h–1

Fed-Batch 2

t>2 h

Feed 13.5 ml h–1

Fed-Batch 3

ta>2 h

Ende

pO2


Feed 4.5 ml h–1

Feed

Zugabeschema

50 % Glucose 0,5 l

Fed-Batch 1

t>2 h t>2 h t>2 h








Organismus

Name A Vorkultur

Beschreibung Erzeugung eines reinen, vermehrungsfährigen P. pastoris-Ino-kulums für die weitere Expansion als Schüttelkultur

Organismus Pichia pastoris, neuer Name Komagataella phaffii

Herkunft Mut+ Stamm, 10–100 µl einer Flüssigkultur

Inokulumvolumen 1 ml Pichia-Erhaltungskultur in 10 ml frischem YPD im 250 ml Erlenmeyerkolben ohne Strömungsbrecher


abhängig von Dichte der Erhaltungskultur

Kulturmedium

Typ Komplexmedium

Name YPD (yeast extract- peptone- dextrose)


20,0 g l–1

20,0 g l–1

Hefeextrakt (Y)Pepton (P)Dextrose (D)


Schüttelhub 25 mm


Temperatur 30 °C

Zeit 8–16 h


Organismus

Name B Kultivierung des Inokulums

Beschreibung Erzeugung eines ausreichenden P. pastoris- Inokulums für die sich anschliessende Kultivierung im Bioreaktor


Herkunft 10 ml Vorkultur aus Schritt A

Inokulumvolumen 10 ml Pichia-Vorkultur in 100 ml frischem BMGY-Medium im 1000 ml Erlenmeyerkolben mit Strömungsbrechern


10 bis 30 g l–1 Zelltrockenmasse

40 41

Kulturmedium

Typ Komplexmedium

Name BMGY (buffered glycerol complex medium)


20,0 g l–1

10,0 g l–1

10,0 g l–1

40 µg l–1

KH2PO4, pH 6.0 (B)Pepton (M)Glycerin (G)Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) (Y)Biotin


Schüttelhub 25 mm


Temperatur 30 °C

Zeit 16 h


Organismus

Name C Kultivierung der Hauptkultur im Bioreaktor

Beschreibung Vorgelagerte Biomasseerzeugung von P. pastoris-Kultur mittels Minifors 2 und anschliessende Erzeugung von rekombinantem Protein in der Methanolfütterungsphase


Herkunft aus Inokulum-Kultur (Schritt B)

Inokulumvolumen 100 ml Inokulum in 1000 ml frischem BSM/PTM1-Medium im 2,5 l Rührkessel mit 2 Impellern, Minifors 2


mehr als 120 g l–1 Zelltrockenmasse möglich

Kulturmedium

Typ Synthetisches VollmediumName BSM (Basal salt medium) und PTM1-Mineralzusatz

ZusammensetzungBSM pH 5.0

26,7 ml l–1

0,93 g l–1

18,2 g l–1

14,9 g l–1

4,13 g l–1

40,0 g l–1

H3PO4, 85%CaCl2 · 2 H2OK2SO4MgSO4 · 7 H2OKOHGlycerin

im Bioreaktor sterilisieren

ZusammensetzungPTM1

6,0 g l–1

0,08 g l–1

3,0 g l–1

0,2 g l–1

0,02 g l–1

0,5 g l–1

20,0 g l–1

65,0 g l–1

0,2 g l–1

5,0 ml l–1

CuSO4 · 5 H2ONaIMnSO4 · H2ONa2MoO4 · 2 H2OH3BO3CoCl2ZnCl2FeSO4 · 7 H2OBiotinH2SO4

jeweils 4,35 ml sterile PTM1-Lösung je l BSM hinzufügen


Temperatur 30 °C


pH 5.0

pO2 >20 %

pO2-Kaskade am Touchscreen des BioreaktorsParameter Beschreibung Sollwert max. zu regelnder

Wertmin. zu regelnder Wert

1 Rührerdrehzahl 500 min–1 500 min–1 1200 min–1

2 Begasungsrate 1 vvm 1 vvm 2 vvm

3 Überdruck 0 bar 0 bar 0 bar

4 pO2 ≥ 20 %

42 43

Feed-SchemaPhase Beschreibung Ziel Start Ende Aktion Proz.

FeedrateFeedrate ml/h

C1 Batch Aufbau Biomasse

0 h 20 h kein Feed

C2 Fed-Batch Gly Aufbau Biomasse

20 h 43 h Glycerin 1 % 4,5 ml h–1

C3 Fed-Batch Gly/MeOH

Induktions-phase

43 h 49 h MeOH 1 % 3,6 ml h–1

C4 Fed-Batch MeOH

Produktions-phase

49 h 97 h MeOH 1 % 10,9 ml h–1

Weitere zu regelnde Parameter am Bioreaktor (a, b, c) oder in eve® (d, e, auch manuell möglich)

Pumpe Zugabe Ziel Stoffangabe Auslöser




d Glycerin-Feed Kohlenstoffquelle (C2+3)550 g l–1 Glycerin

50 % Glycerin and 12 ml l–1 PTM1

während Phase C2/3

e Methanol-Feed Kohlenstoffquelle (C3+4)395 g l–1 Methanol

100 % Methanol and 12 ml l–1 PTM1

während Phase C3/4

Vorschläge zur Modifikation dieses RezeptesUm die Biomasseausbeutung zu erhöhen, können modifizierte Medien- und Zusammenset-zungen für die Batch-Phase und die Feeds herangezogen werden. Bezüglich Produktausbeu-te lohnt es sich auch, das Methanolfeed zu optimieren, um toxische Effekte in Grenzen zu halten. Letztere sollte nie über 32 °C steigen, da hier die Proteinproduktion eingestellt wird. Daher wird während der Vermehrungs- und Produktbildungsphase eine effiziente Kühlung notwendig. Ein Austesten der Produktstabilität im gewählten pH-Bereich ist genauso wich-tig, um den pH-Wert gegebenenfalls anzupassen, oder dem Medium Protease-Inhibitoren wie Casaminosäuren hinzuzufügen, welche die Stabilität des Produktes erhöhen.

In der Übergangsphase zwischen Glycerin- und Methanolstoffwechsel kann eine kurze «Hungerphase» hilfreich sein. In anderen Fällen kann es auch wirksam sein, das Glyce-rin-Feed herunterzufahren und gleichzeitig das Methanolfeed zu steigern. Wichtig ist hier, die pO2-Spitze abzuwarten, welche ein Indikator dafür ist, dass das gesamte Glycerin verbraucht ist.

Eine zweite Methanolfütterungsphase mit reduziertem Methanolfeed kann ebenso hilf-reich sein. Diese soll sich an die Phase C4 anschliessen und die zelltoxische Wirkung von Methanol umgehen.

Die Evaluierung des Stammes deutet auf deren Fähigkeit hin, wie effizient Methanol ver-wertet wird (Mut+ versus MutS). Der gezielte Einsatz von USP-Methoden kann ebenfalls einen beträchtlichen Ausbeuteunterschied bezüglich Biomasse und Produkt ausmachen.

Notizen

45

6.1 Kontaminationen vermeiden

• Kontaminationen können verschiedenste Ursachen haben. Die häufigste ist eine Verunreinigung der Starterkultur. Dies kann auf vielen Wegen geschehen: unzureichend gereinigte oder autoklavierte Kulturgefässe oder Reaktorkomponenten, konta-minierte Starterkulturen oder Medienkomponenten sowie durch nicht sachgemässe Handhabung.

• Zudem kann ein Organismus, der in statischer Kultur als Kontaminante nur langsam wächst, im Bioreaktor plötzlich die perfekten Wachstumsbedingungen vorfinden und den eigentlich zu kultivierenden Organismen innerhalb kürzester Zeit über-wachsen.

• Darauf achten, dass beim Autoklavieren die Zieltemperatur im Bioreaktor ausreichend lange gehalten wird. Der Temperaturfüh-ler sollte im Tauchrohr des Kulturgefässes eingesetzt sein.

• Bei einem doppelwandigen Kulturgefäss muss genügend Wasser im Mantel vorhanden sein, sodass ein guter Wärmeübergang während der Sterilisation gewährleistet werden kann.

• Alle Dichtringe sollten in einwandfreiem Zustand sein, d.h. keine Anzeichen für Knicke, Abflachungen oder anderweitige Gratbil-dungen vorhanden sein; im Zweifelsfall lieber einmal zu viel aus-tauschen, insbesondere wenn eine Dichtung nicht richtig sitzt.

6.2 Wachstumsmaximierung durch Regelung der Gelöstsauerstoffkonzentration

• In aeroben Bioprozessen ist die Menge an Gelöstsauerstoff ein wichtiger Parameter, der über Wohl oder Wehe des Bioprozesses entscheidet. Je nach Anforderung der Organismen muss dies individuell konfiguriert und mittels verschiedener Parameter wie z.B. TotalFlow, Rührerdrehzahl und Gasmix gesteuert werden. Eine pO2-Kontrolle mit einer Genauigkeit im Bereich von ±5 % bis 10 % vom Sollwert wird von den meisten Anwendern akzeptiert.

• Wurde pO2 als Parameter eingeschaltet und in der Kaskade am Bioreaktor konfiguriert?

• Sind die Grenzen der einzelnen Parameter weit genug gewählt, um dem hohen Sauerstoffbedarf während der exponentiellen Wachstumsphase gerecht werden zu können?

• Ist die Begasungsrate ausreichend gewählt?• Wurde viel Antischaummittel hinzudosiert? Dies kann einen ef-

fizienten Sauerstoffübergang verhindern. Alternativ kann schon zum Ausgangsmedium Antischaummittel in der Menge von 1:20.000 hinzugeführt werden, damit der Schaumentstehung vorgebeugt wird.

• Für schnell wachsende Kulturen mit hoher Zelldichte ist womög-lich die Zugabe von reinem Sauerstoff notwendig. Die meisten Bioreaktoren sind ab Werkfür eine Sauerstoffzufuhr konfiigu-riert, andernfalls sollte eine Aufrüstung angefragt werden.

• Nach dem Aufbrauchen der Nährstoffe, steigt die Gelöstsau-erstoffkonzentration wieder an. Ein solches Verhalten kann bei einem Fed-Batch-Prozess zur Festlegung des Feed-Zeitpunktes verwendet werden. Die Restkonzentration der Kohlenstoffquelle sollte jedoch untersucht werden, sodass es nicht zur Verwechs-lung mit einem kurzzeitigen pO

2-Sprung kommt.

6.3 Kulturvolumen beibehalten

• Beim Autoklavieren des Mediums im Reaktor können Volumen-verluste von bis zu 10 % auftreten. Damit das Medium nicht zu stark konzentriert wird, sollte dies durch Zugabe von sterilem Wasser vor der Inokulation des Reaktors ausgeglichen werden.

• Wird während der Kultivierung (insbesondere) ohne Feed eine Abnahme des Kulturmediums ersichtlich, sollte der Status des Abgaskühlers sowie dessen Kühlmittelzulauf überprüft werden, und, ob die Temperaturregulation angeschaltet ist.

• Etwaige Probenahmen sollten bei kleineren Kulturgefässen auf 10 ml begrenzt werden. Dazu kann auch der Einsatz des Super Safe Samplers beitragen.

6.4 Schaumbildung vermeiden

• Schaumbildung tritt vorzugsweise in proteinreichen Medien mit hoher Begasungsrate und/oder Rührerdrehzahl auf. Dieser kann nicht nur den Bioprozess stören sondern auch den Mikroorganis-men und dem finalen Produkt schaden.

• Zu Beginn einer Batch-Kultur ist unter Umständen keine oder nur geringe aktive Begasung nötig. Anschliessend kann die Begasung stetig erhöht werden. So wird gewährleistet, dass aus-reichend Sauerstoff zur Verfügung steht, ohne unnötig Schaum zu bilden.

• Wenn möglich, sollte ein kleiner Anteil Antischaummittel dem Medium zugesetzt werden, um von Beginn an die Schaum-bildung effektiv zu unterbinden. Bei zu hoher Dosierung von Antischaummitteln wird der Sauerstoffübergang begrenzt und damit auch das mikrobielle Wachstum aerober Organismen. Ge-nerell gilt: Schaumbildung zu vermeiden ist einfacher als diesen im Nachhinein zu beseitigen, weshalb in Summe ein rechtzeiti-ges Zusetzen von Antischaummittel den zusätzlichen Verbrauch klein halten kann.

6. Tipps für einen erfolgreichen Bioprozess

46 47

6.5 Funktionsfähiger Abgasfilter

• Es ist von grosser Wichtigkeit, dass der Abgasfilter trocken ist. Ist dies nicht der Fall, verstopft die hydrophobe Membran, was wiederum den Gasfluss unterbindet und daher zu einem uner-wünschten Druckaufbau im Kulturgefäss bis hin zum Stopp der Begasung führt.

• Wird während des Bioprozesses Feuchtigkeit im Abgasfilter auf-fällig, so bleiben mehrere Optionen, um diese zu beseitigen:

– Reduktion des Gasflusses, sofern möglich, – Erhöhung des Kühlmittelzulaufes in den Abgaskühler oder

Verwendung eines besseren Kältemittels z.B. mit niedrigerer Temperatur,

– Nutzung eines grösseren Filters, – Nutzung eines Tiefenfilters, der nicht in dieser Art verstopfen

kann.• Wenn das Problem durch zu starke Schaumbildung verursacht

wird, kann eine Schaumfalle zwischen dem Abgaskühler und dem Abgasfilter helfen. Diese kann mit einfachsten Mitteln aus einer Flasche mit ein wenig Antischaummittel hergestellt werden, durch welches das Abgas geleitet wird, bevor es zum Filter gelangt.

6.6 Konstante Pumpengeschwindigkeit

• Wenn Marprene-Schläuche verwendet werden, sollte die Pumpe circa. 30 Minuten laufen, bevor die Durchflussrate bestimmt wird, da Marprene-Schläuche sich mit der Zeit dehnen. Auch wiederholtes Autoklavieren kann einen solchen Effekt haben.

• Die Flussrate kann mit der Viskosität der Flüssigkeit variieren. Ein Feed-Medium mit hoher Zuckerkonzentration kann daher bei gleicher Pumprate eine andere Durchflussrate haben als eine Lösung mit geringem Zuckergehalt.

• Wichtig ist auch, dass die Zufuhrschläuche für den Feed und andere Lösungen auf dem Weg zur Deckelplatte des Bioreaktors weder geknickt noch gequetscht sind.

• Ebenso darf die Klemme, die für das Autoklavieren angebracht wird, im Anschluss nicht die Zufuhr blockieren.

• Wenn eine hohe Präzision für die Zuleitung des Feeds not-wendig ist, so sollte dies als gravimetrischer Feed mittels einer Waage überwacht werden. Der Bioreaktor kann somit das Fee-dback des abnehmenden Gewichts auf der Waage nutzen, um die Pumprate automatisch anzupassen, sodass die gewünschte Durchflussrate eingehalten wird.

6.9 Tipps für Fed-Batch-Prozesse

• Ein Fed-Batch-Prozess sollte nicht unter dem Minmalvolumen gestartet werden, um zu gewährleisten, dass alle Sensoren und die Impeller ausreichend mit Kulturflüssigkeit bedeckt sind.

• Ein überfülltes Kulturgefäss ist ebenso wenig von Nutzen. Ein Minimum von 20–30 % Kopfraum im Kulturgefäss sollte immer verbleiben.

• Eine Berechnung der Menge der benötigten Kulturflüssigkeit erspart lästiges Nachproduzieren und/oder Bestellen und einen reibungslosen Ablauf des Bioprozesses. Genauso wichtig ist es, dass die eingesetzte Pumpe die gewünschten Fördermengen erreicht.

• Sofern eine sehr genaue Durchflussrate eingehalten werden soll, ist es ratsam, diese nicht in der ersten Betriebsstunde zu bestimmen und einzustellen, da die Schläuche sich noch dehnen können. Um diese unerwünschten Nebeneffekte zu umgehen, kann das gravimetrische Füttern angewendet werden.

• Die Kohlenstoffquelle ist nicht zwangsläufig der limitierende Faktor. Ebenso sind Spurenelemente und die ausreichende Zufuhr einer Stickstoffquelle unerlässlich für das Gelingen des Prozesses. So kann zum Beispiel eine höhere Biomasseausbeute an E. coli erreicht werden, wenn als Base im Prozess eine Ammo-niumlösung verwendet wird.

• Die entstehende (Ab-) Wärme, insbesondere bei Hochzelldichte-prozessen, sollte nicht unterschätzt werden. Eine ausreichende Kühlung kann schon durch einen Wärmetauscher mit Wasser-einlass erreicht werden.

• Der Stoffwechselzustand der Kultur kann durch die Berechnung des respiratorischen Quotienten genauer bestimmt werden, sofern ein Abgasanalysator an den Bioreaktor angeschlossen ist.

• Wenn die Gasflussrate zu stark erhöht wird (nicht über 2 min–1), wird zu viel Flüssigkeit aus der Kulturflüssigkeit getragen. Das lässt zum einen das Kulturvolumen unnötig schrumpfen und kann andererseits zu einem verstopften Abgasfilter führen.

6.7 Erfolgreiche Biomasseausbeute

• Ein Fed-Batch-Kultivierungssystem kann wesentlich besser ge-eignet sein, um ausreichende Biomassemengen zu produzieren.

• Die Starterkultur sollte sich vor der Inokulation des Bioreaktors in der exponentiellen Wachstumsphase befinden, um eine maxima-le Wachstumsrate zu erzielen.

• Wenn irgendein Nährstoff (und dies muss nicht zwangsläufig die Kohlenstoffquelle sein) limitierend wirkt, wird das Wachstum der Mikroorganismen begrenzt. Deshalb sollte immer eine ausrei-chende Zufuhr aller Nährstoffe und eine gute Versorgung mit Sauerstoff gewährleistet sein.

• Genetisch veränderte Stämme können wesentlich empfindlicher auf z.B. Scherstress reagieren oder an sich aufgrund der geneti-schen Veränderungen langsamer wachsen.

• Indem sichergestellt wird, dass die Starterkultur ausreichend vital, mit hohen Zellzahlen und in bestmöglicher Anpassung an die Bedingungen im Bioreaktor gezüchtet wird, kann die Lag-Phase möglichst kurz gehalten werden.

6.8 Erfolgreiche Proteinausbeute

• Wenn die Nährstoffzufuhr so sehr im Überfluss erfolgt, dass der Stoffwechsel der Mikroben nur auf Wachstum gepolt ist, so werden keine Stoffwechselprodukte ausgeschieden. Den Biopro-zess als ein Fed-Batch-Verfahren zu führen, kann Abhilfe leisten.

• Häufig sind die Wachstumsbedingungen des Mikroorganismus nicht optimal für die Produktion des z.B. angestrebten Proteins, sodass ggf. die Temperatur oder der pH darauf angepasst werden müssen, um die Proteinausbeute und -stabilität zu verbessern.

• Ausserdem sollte sehr sorgfältig geprüft werden, ob der entspre-chend kultivierte Stamm die angestrebten Ausbeuten produzieren kann, was vorab schon mittels Fachliteratur evaluiert werden kann.

• Ebenso wichtig ist es, zu wissen, ob der kultivierte Stamm Toxine oder wachstumshemmende Substanzen abgibt, welche durch das Wachstum, die Auflösung von Zellen oder deren Stoffwech-sel produziert werden kann. Solche Einflussfaktoren können die Proteinproduktion über den Zeitraum von ein paar Tagen durchaus beeinträchtigen.

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7. Weiterführende Literatur

7.1 Biotechnologie

Schüler J. Die Biotechnologie-Industrie: ein Einführungs-, Über-sichts- und Nachschlagewerk. Springer; 2015.

Clark D, Pazdernik N. Molekulare Biotechnologie – Grundlagen und Anwendungen. Spektrum, Akad. Verlag; 2013.

Renneberg R, Berkling V. Biotechnologie für Einsteiger. Springer Spektrum; 2013.

Thieman WJ, Palladino MA, Hopf NW. Biotechnologie. Pearson Studium; 2007.

www.biotechnologie.de

7.2 Bioprozesstechnik

Chmiel H. Bioprozesstechnik. Spektrum Akademischer Verlag; 2011.

Müller-Esterl W. Biochemie: Eine Einführung für Mediziner und Naturwissenschaftler. 2. Auflage Springer Spektrum, 2011.

7.3 Mikrobiologie

Slonczewski JL, Foster JW. Mikrobiologie: Eine Wissenschaft mit Zukunft. Springer Spektrum; 2012.

Bast, E. Mikrobiologische Methoden: Eine Einführung in grundle-gende Arbeitstechniken. 3. Auflage Springer Spektrum, 2014.

Stephenson, FH. Mathematik im Labor: Ein Arbeitsbuch für Mole-kularbiologie und Biotechnologie. 1. Auflage, 3. korr. Nachdruck. Springer Spektrum, 2011.

7.4 Praktische Laborarbeit

Mülhardt, C. Der Experimentator: Molekularbiologie/ Genomics. 7. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2013.

Rehm, H. Der Experimentator: Proteinbiochemie/ Proteomics. 6. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009.

7.5 Populärwissenschaftliche Publikationen

Koolman J, Moeller H, Röhm KH. Kaffee, Käse, Karies ...: Bioche-mie im Alltag. Koolman J, Moeller H, Röhm KH, editors. Wein-heim: Wiley-VCH; 2009.

Dixon B. Der Pilz der John F. Kennedy zum Präsidenten machte und andere Geschichten aus der Welt der Mikroorganismen [Inter-net]. Spektrum Akademischer Verlag; 1994.

Renneberg R, Bofinger M, Chow MF. Katzenklon, Katzenklon: ... und andere Biotechnologie-Geschichten. Springer; 2008.

Renneberger R, Berkling V. Biotechnologische Leckerbissen. 1. Auflage Heidelberg: Springer Spektrum; 2013.

Anthes, E. Frankensteins Katze: Wie Biotechnologen die Tiere der Zukunft schaffen. Springer Spektrum 2014.

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8. Glossar

A

AbgasanalysatorBestimmt die Konzentration eines oder mehrerer Gase im Abgas einer Kultur. Dies kann genutzt werden, um indirekte Schlüsse auf den Stoffwechselzustand der Kultur zu ziehen. Bei aeroben Bioprozessen wird typischerweise die Konzentration an Sauer-stoff und Kohlendioxid gemessen. Bei anderen Bioprozessen, wie z.B. bei der Kultivierung von Pichia pastoris, kann die im Reaktor vorhandene Methanolkonzentration als indirekter Indikator für die Metabolitenkonzentration im Kulturmedium herangezogen werden.

Absterbe-PhaseIm Anschluss an die stationäre Phase wird die Absterberate grösser als die Wachstumrate, sodass während der sogenannten Absterbephase die Zahl lebensfähiger Mikroorganismen sinkt.

AerobIn der Gegenwart von (Luft-)Sauerstoff. Die meisten Bioprozesse zur Proteinproduktion laufen aerob ab.

AktorSind Antriebselemente, welche elektrische Signale in mechanische Bewegung oder andere physikalische Grössen umsetzt. Durch seine Aktoren ist ein Bioreaktor in der Lage, steuernd auf den Bioprozess einzugreifen. Wegen der englischen Wortherkunft (actuator) wird ein Aktor oft auch Aktuator genannt.

AnaerobIn Abwesenheit von (Luft-)Sauerstoff. Selbst aerobe Prozesse können abschnittsweise anaerob ablaufen. Dies passiert, wenn die Gelöstsauerstoffkonzentration durch ungünstige Prozessführung gegen Null geht.

AnimpfstutzenEin spezieller Einlassstutzen, wodurch das Inokulum aseptisch in den Bioreaktor überführt werden kann. Die gebräuchlichste Form besteht aus einer Silikonmembran, die mit einer Nadel oder Sprit-ze durchstochen wird, nachdem der umliegende Bereich z.B. mit Ethanol und/oder einer Flamme sterilisiert wurde.

Anlauf-PhaseS. Lag-Phase

AntischaumsensorS. Schaumsensor

AntischaummittelEine Chemikalie, welche die Bildung von Schaum im Bioreaktor vermeiden soll. Dies können Silikon- oder Mineralöle, Alkohole oder eine spezielle Mischung sein. Antischaummittel sind grenzflä-

chenaktiv und erhöhen die Neigung des Schaums, in sich zusam-menzufallen. Überschüssiges Antischaummittel kann die Gastrans-ferrate negativ beeinflussen.

ArbeitsvolumenDieses umfasst typischerweise zwei Drittel des Totalvolumens des Bioreaktors. Für tierische Zellkulturen, wo für den Gasübergang aus dem Kopfraum ein grösseres Verhältnis der Flüssigkeitsober-fläche zum Kulturvolumen benötigt wird, werden häufig nur bis zu 50 % des gesamten Reaktorvolumens genutzt.

Aseptische ArbeitsweiseBeinhaltet die Handhabung von Kulturen in einer Art und Weise, sodass Kontamination mit Mikroorganismen anderer Art während der Stammpräparation, Inokulation und der Probennahme etc. minimiert werden.

AutotrophWenn der für die Zellbausteine benötigte Kohlenstoff durch die Fixierung von Kohlenstoffdioxid bereitgestellt wird, so spricht man von Autotrophie.

B

BasiseinheitDer zentrale Teil des Bioreaktors, welcher den Controller sowie Sensoren und Aktoren beinhaltet oder ansteuert und damit die Re-gelung der Stellgrössen übernimmt. Eine Basiseinheit kann für ein oder mehrere Kulturgefässe zuständig sein (s. Parallel-Bioreaktor).

Batch-KulturEine Betriebsweise im geschlossenen System, auch Satzbetrieb genannt. Hierbei sind vor Beginn des Bioprozesses alle Nährstoffe und Zusätze im Medium vorhanden und werden im Verlauf des Bioprozesses aufgebraucht. Es gibt neben der Begasung und den Korrekturmitteln zur pH-Regelung oder gegen Schaumbildung keine weitere Zuflüsse in das System.

BiomasseEin Begriff für die Stoffmasse von Lebewesen. In Bioprozessen bezieht sich die Biomasse auf die Quantität der Organismen in einer Kultur. Diese kann durch direkte Messungen wie Bestim-mung des Trockengewichts, des Feuchtgewichts, der Zellanzahl, der Lebendzellzahl oder durch indirekte Bestimmungen wie zum Beispiel optische Dichte und einer entsprechenden Korrelation ermittelt werden.

BioreaktorEin System, das aus einer Basiseinheit und einem oder mehreren Kulturgefässen besteht, an die ggf. weitere Sensoren oder Akto-ren als Peripherie angeschlossen sind. Ein Bioreaktor gewährleistet

die Steuerung und die Regelung eines Bioprozesses und stellt damit optimale Wachstumsbedingungen für die Mikroorganismen bereit. Da ein Bioprozess nicht zwangsläufig eine Fermentation ist, schwindet der früher gebräuchliche Begriff Fermenter allmählich aus dem Sprachgebrauch.

C

ChemotrophStammt die Energie aus organischen Verbindungen, dann handelt es sich um chemotrophe Organismen.

Cleaning-in-Place (CIP)Wird klassischerweise in grösseren, in-situ-sterilisierbaren Biore-aktoren praktiziert, wo das Auseinanderbauen und manuelle Rei-nigen unverhältnismässig aufwändig wäre. Mittlerweile findet die Technologie mit dem LabCIP für den Labfors 5 auch in die Welt der Kleinbioreaktoren Einzug. Beim Cleaning-in-Place werden ver-schiedene Reinigungslösungen so durch den Bioreaktor und seine Rohr- oder Schlauchleitungen gepumpt, dass alle produktberüh-renden Flächen gereinigt werden. CIP-Systeme können mobil oder direkt in den Reaktor integriert sein.

Crabtree-EffektDieser Stoffwechseleffekt wurde zuerst in Backhefe (Saccharomy-ces cerevisae) beobachtet und ist eine Überlaufreaktion bei Glu-coseüberangebot unter aeroben Bedingungen, durch die Ethanol gebildet wird. Daher wird es auch Glucose-Effekt genannt. Dieser reprimiert die Expression respiratorischer Gene, weshalb das Zwi-schenprodukt Pyruvat nicht über den Zitratzyklus und die Elekt-ronentransportkette oxidiert, sondern zu Ethanol reduziert wird, was eine wesentlich geringere Energieausbeute zur Folge hat. Aus diesem Grund ist der Crabtree-Effekt auch wirtschaftlich relevant: Hefe sollte unter Umgehung des Crabtree-Effektes vermehrt wer-den, um die Wirtschaftlichkeit des Prozesses zu erhöhen.

D

DOAbkürzung für dissolved oxygen. S. Gelöstsauerstoff.

DoppelmantelManche Kulturgefässe sind doppelwandig. In diesem Doppelman-tel wird Wasser zur Heizung oder Kühlung des Prozesses zirkuliert. Er besitzt einen Zu- und Ablauf und kann in geschlossenen und offenen Zirkulationssystemen eingesetzt werden.

Downstream-ProcessingBedeutet die Aufarbeitung eines Produktes, welches sich an den eigentlichen Bioprozess anschliesst.

DriftWerden Sensoren über einen längeren Zeitraum eingesetzt, kann sich die Qualität des Messwertes ändern. So kann sich beispiels-weise der Messwert des pH-Sensors während eines längeren Bioprozesses ändern. Dem kann durch eine Nachjustierung während des Bioprozesses, der sogenannten Produkt-Kalibrierung, entgegengewirkt werden, um weiterhin eine präzise Messung und somit eine akkurate Regelung zu gewährleisten.

E

ElektrodeS. Sensor.

Einwandiges KulturgefässEin einwandiges Kulturgefäss hat den Vorteil, dass es weniger wiegt und einfacher in der Handhabung ist. Anders als für Kultur-gefässe mit Doppelmantel muss die Basiseinheit für die Tempe-raturregelung jedoch über einen Temperierblock oder über eine Heizmanschette und einen Kühlfinger verfügen.

EinblasrohrS. Sparger

Exponentielle PhaseS. Log-Phase

F

Fed-Batch-KulturDurch die Zufuhr von Nährstoffen und Supplementen zu einer Batch-Kultur kann die Biomasse-Ausbeute und/oder die Produktion von Sekundärmetaboliten/rekombinanter Proteine verbessert werden.

FehlerIn der Regeltechnik bezeichnet dies die Abweichung zwischen dem Soll- und dem Istwert einer Prozessgrösse. Anhand des Fehlers kann der Controller errechnen, wie stark er seine Aktoren ansteuern muss, um den vorgegebenen Sollwert zu erreichen.

FermentationWortwörtlich, die enzymatische Umwandlung organischer Stoffe durch Mikroorganismen in Säuren, Gase oder Alkohole. Fermen-tation kommt vom lateinischen Wort fermentum und wird häufig fälschlicherweise gleichbedeutend mit technischen Bioprozessen, die mittels Mikroorganismen, Zellen oder Enzymen stattfinden verwendet.

FermenterS. Bioreaktor.

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G

Gasmix / GaszusammensetzungDie Steuerung der Gaszusammensetzung ist am häufigsten bei tierischen Zellkulturen anzutreffen, findet jedoch auch bei mikro-biellen Bioprozessen Anwendung. Je nach Ausstattung verfügen Bioreaktoren über eine Kombination aus Massendurchflussreglern und/oder Magnetventilen und können so eine frei wählbare Kom-bination aus Luft, Sauerstoff, Stickstoff oder anderen Gasen er-zeugen. Somit steht auch die Gaszusammensetzung als Aktor für die Regelung der Gelöstsauerstoffkonzentration zur Verfügung. Insbesondere bei Bioreaktoren für tierische Zellkulturen findet sich zudem oft eine zusätzliche Gasstrecke für Kohlendioxid, welches anstelle einer flüssigen Säurelösung für die pH-Regelung verwen-det wird.

GelöstsauerstoffkonzentrationDie Gelöstsauerstoffkonzentration ist ein entscheidender Para-meter für aerobe Bioprozesse, da nur im Kulturmedium gelöster Sauerstoff für die Mikroorganismen verfügbar ist. Daher wird in Bioreaktoren der Sauerstoffpartialdruck pO2 (englisch manchmal auch DO) über einen entsprechenden Sensor gemessen. Die Angabe erfolgt meist relativ bezogen auf den maximal unter den verwendeten Bedingungen erreichbaren Sauerstoffpartialdruck und liegt daher meist zwischen 0 % und 100 %. Es finden sich jedoch auch absolute Angaben, z.B. in mbar.

H

HeizblockS. Temperierblock

HeterotrophStammt der Kohlenstoff aus organischen Kohlenstoffverbindun-gen, so handelt es sich um Heterotrophie.

I

ImpellerEin Rotor, der über eine Anzahl von Rührblättern verfügt und zur Durchmischung des Bioreaktoreninhaltes dient. Es existiert eine Vielzahl von Impeller-Designs je nach Anwendung. Für mikrobielle Bioprozesse werden häufig Rushton-Impeller genutzt, während in Zellkulturprozessen meist die schiffsschraubenartigen Schräg-blatt-Impeller eingesetzt werden. Letztere eignen sich besonders gut für eine schonende, scherkraftarme Durchmischung auch bei niedrigen Drehzahlen. Rushton-Impeller hingegen werden mit höheren Drehzahlen verwendet und weisen hierbei eine sehr gute Durchmischung auf.

kLa (volumetrischer Stoffübergangskoeffizien)Beschreibt die Effizienz des Sauerstoffübergangs. Der kLa ist abhängig von der Geometrie des Kulturgefässes, dem Design des Spargers, dem Energieeintrag des Rührers und der Anzahl und Design der Strömungsbrecher. Zur Messung des kLa existiert eine Vielzahl an Methoden, zwischen welchen die Ergebnisse jedoch sehr stark abweichen können. Nach gewöhnlicher Definition wird der kLa in h–1 ausgedrückt. Rührkesselreaktoren erreichen typischerweise zwischen 100 und 200 h–1. Siehe auch Sauerstoff-transportrate.

KulturGesamtheit der Biomasse im Bioreaktor, welche zumeist in Flüssig-medium wächst.

KulturgefässTypischerweise aus Borosilikatglas oder rostfreiem Stahl und mit einer Deckelplatte mit dazwischenliegendem Dichtungsring verschlossen. Der Boden des Kulturgefässes kann flach oder rund sein. Gefässe mit mehr als 10 l Arbeitsvolumen sind doppelwan-dig, sodass die Temperierung über im Doppelmantel zirkulierte Flüssigkeit oder Dampf erfolgen kann. Die Grösse und Propor-tionen der Kulturgefässe sind Schlüsselparameter und charak-teristisch für bestimmte Bioprozesse und daher ebenso für die Bioreaktorspezifikation.

KohlenstoffquelleTypischerweise ein Kohlenhydrat wie Glucose, welches in einem Stoffwechselprozess zum Aufbau von Biomasse und Wachstum von Organismen genutzt wird. Die Wahl der Kohlenstoffquelle für einen Bioprozess ist sehr wichtig, da damit Einfluss auf die (Nicht-)Bildung von Nebenprodukten genommen werden kann. Dies ist der Fall beim Wachstum von E. coli auf Glycerin, da hier kein Ace-tat gebildet wird – bei Wachstum auf Glucose hingegen schon. Ein Wechsel der Kohlenstoffquelle kann auch als Schalter zur Produktion eines bestimmten Proteins fungieren, wie z.B. wenn bei der Kultivierung von Pichia pastoris von Glucose auf Methanol als Kohlenstoffquelle gewechselt wird.

Kontinuierliche KulturNach einer Batch-Phase wird so viel frisches Medium zugeführt wie zur gleichen Zeit abgeführt wird. Das mikrobielle Wachstum hängt dabei von der Wahl der Durchflussrate und der Nährstoff-konzentration im Zufluss ab. Diese Konfiguration wird Chemostat genannt. Hierbei bleiben alle Parameter inklusive der Biomasse-konzentration konstant.

KopfraumEin Anteil des Gesamtbioreaktorvolumens, der typischerweise 25 bis 30 % des Totalvolumens beträgt. Der Kopfraum des Bioreaktors ist nicht mit Kulturflüssigkeit gefüllt, um ausreichend Platz für den Gasübergang und etwaige Schaumbildung zu belassen.

InokulumDie Menge der Biomasse, die beim Start des Bioprozesses in den Bioreaktor gegeben wird. Idealerweise hat das Inokulum eine hohe Lebendzellzahl und befindet sich in der exponentiellen Wachstumsphase. Ein typisches Inokulumvolumen sind 5 bis 10 % des Arbeitsvolumens des Bioreaktors.

In-situ-sterilisierbarer (ISS) BioreaktorS. Sterilisation-in-Place (SIP).

InstrumentationBezeichnet die Mess-und Regelelemente eines Bioreaktors. Ein typischer Regelablauf hat einen Sensor, ggf. mit einem Signal-verstärker, eine lokale Anzeige und Aktoren wie Ventile oder Pumpen.

K

KalibrierungEine Methode, bei der bekannte Referenzpunkte herangezogen werden, um diese mit Messungen eines Sensors zu korrelieren und diesen innerhalb eines bekannten Toleranzrahmens einzu-stellen. Da viele Sensoren mit der Zeit andere Messwerte liefern können (s. Drift), ist eine regelmässige Kalibrierung empfehlens-wert, um den Fehler durch diesen Effekt zu minimieren. Abhängig vom Sensortyp, den Referenzstandards und dem Einfluss des Sterilisationsvorganges müssen die Sensoren unterschiedlich häu-fig kalibriert werden. Manche Sensoren altern schneller als andere und kommen dann an einen Punkt, wo sie nicht mehr kalibriert werden können. Je nach Sensor kann die Kalibrierung direkt an der Bedieneinheit des Bioreaktors, an einem separaten Bedienge-rät oder nur durch Techniker des Herstellers durchgeführt werden.

KaskadeEin Kaskade beschreibt eine Regelmethode im Bioreaktor bei der die Variation mehrerer dem Zweck dienlicher Parameter im Rahmen der vorab eingegebenen Grenzen gesteuert wird. Dies kann zum Beispiel zur pO2-Regelung genutzt werden, für welche Parameter wie die Rührerdrehzahl, der Gasmix, Druck und Bega-sungsrate herangezogen werden können.

KatalysatorStoff, der die Aktivierungsenergie herabsetzt und unverbraucht aus der Reaktion hervorgeht. In einer Zelle sind das meistens Enzyme.

L

LabormassstabTypischerweise handelt es sich hier um Bioreaktoren mit Arbeits-volumina zwischen 0,1 l und 10 l.

Lag-PhaseEine Phase, die direkt der Inokulation des Mediums folgt und in welcher sich die Mikroorganismen auf die vorherrschenden Be-dingungen einstellen müssen. Während dieser Anpassungsphase bereiten sich die Mikroorganismen auf die exponentielle Wachs-tumsphase vor. Sie kann bei mikrobiellen Kulturen typischerweise 1 bis 2 h und bei Zellkulturen 24 h oder mehr dauern.

LastenheftEine detaillierte Liste mit Anforderungen des Auftraggebers an einen Bioreaktor, mit welchem Funktionsumfang der Hersteller diesen konzipieren soll. Im Englischen wird häufig von einem URS (User Requirement Specification) gesprochen.

Log-PhaseDie Phase, während derer sich die Mikroorganismen mit maximal möglichen Wachstumsrate vermehren. Dies entspricht einem exponentiellen Wachstum. In Batch-Prozessen, bei denen alle Nährstoffe im Überschuss vorgelegt werden, wird die Teilung der Organismen in diesem Stadium durch keinerlei Faktoren limitiert und die spezifische Wachstumsrate ist maximal. Wird z.B. in einem Fed-Batch-Prozess eine Nährstofflösung exponentiell, jedoch mit einer geringeren Rate zugegeben, stellt sich eine konstante, jedoch niedrigere spezifische Wachstumsrate ein. In beiden Fällen kann es, insbesondere bei Bakterien- und Hefekulturen, Beglei-terscheinungen wie Hitzeentwicklung, Ansäuern des Mediums, schnelle Nährstofferschöpfung und das Eintreten einer Sauerstoff-limitierung geben. Die Log-Phase kann zwischen einigen Stunden bis mehreren Tagen andauern, je nach kultiviertem Organismus.

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M

MaillardreaktionAls nichtenzymatische Bräunungsreaktion entstehen aus Ami-nosäuren oder Peptiden und reduzierenden Verbindungen wie Zuckern neue, meist wohlriechende Verbindungen. Von grosser Relevanz ist diese Reaktion beim Kochen und in der Lebensmitte-lindustrie, da daher das Aroma und die Färbung von Geröstetem, Gebackenen oder Gebratenen stammen. Auch bei der Vorberei-tung eines Bioprozesses findet diese Reaktion beim Autoklavieren von protein- und zuckerhaltiger Nährlösung statt, weshalb diese Komponenten separat autoklaviert werden sollten.

Massendurchflussregler (Mass Flow Controller, MFC)Ein Gerät, welches den Gasvolumenstrom präzise misst und regelt, den aktuellen Gasvolumenstrom elektronisch an den Bioreaktor meldet, und vom Bioreaktor Sollwerte beziehen kann. Sind am Bioreaktor mehrere Gaseingänge vorhanden, so können diese ent-weder über getaktete Magnetventile mit einem einzigen Massen-durchflussregler verbunden werden oder jeweils mit einem eigenen Massendurchflussregler ausgestattet werden, um verschiedene Gasgemische herzustellen. Massendurchflussregler sind somit ideal zur Regelung der Gelöstsauerstoffkonzentration geeignet.

P

Parallel-BioreaktorZwei oder mehr Bioreaktoren, welche mit einem gemeinsamen Mess- und Kontrollsystem ausgestattet sind und in Gruppen an-gesteuert werden, bilden einen Parallel-Bioreaktor. Je nach Modell handelt es sich um vereinfachte, stark miniaturisierte Rührkessel-reaktoren, die nur die absoluten Standardfunktionen eines (meist Rührkessel-) Bioreaktors wie pH-Messung und Durchmischung beherrschen. Andere Modelle wie der Multifors 2 verwenden trotz des verkleinerten Arbeitsvolumens dieselbe Technologie, wie sie in grossen Bioreaktoren anzutreffen ist, und lassen sich ebenso durch leistungsstarke Optionen wie zusätzliche Sensorik erweitern. Generelle Schlüsselpunkte sind die Einfachheit der Bedienung und somit die Geschwindigkeit, mit der Bioprozesse durchgeführt werden können. Anwendungen von Parallel-Bio-reaktoren beinhalten Prozessoptimierung, statistische Analyse, Scale-Down von grösseren Massstäben sowie die Erforschung des Einflusses einzelner Parameter, die variiert werden.

PeristaltikpumpeEine Pumpe, die über einen Schrittmotor angetrieben wird und einen Walzenkopf in einem festen Gehäuse besitzt. Geeignete Schläuche werden zwischen den Walzen und dem Gehäuse hin-durchgeführt, sodass mit der peristaltischen Bewegung Flüssigkeit durch den Schlauch z.B. aus einem Vorratsgefäss in den Bioreak-tor gefördert wird.

R

Rekombinante ProteineEin Protein, welches mittels tierischer oder Bakterienzellen durch gezielte genetische Veränderung dieser Zellen exprimiert wird. Je nachdem, wo das Protein exprimiert wird, entscheidet sich dadurch die Extraktions- und Aufreinigungsstrategie. Sind meh-rere Kopien des zu exprimierenden Genes vorhanden oder den Zellmetabolismus störende Gene entfernt, kann die Produktion des rekombinanten Proteins weiter angekurbelt werden.

Respiratorischer Quotient (RQ)Der RQ wird aus dem Verhältnis des Sauerstoffverbrauchs zum Kohlenstoffdioxidausstoss berechnet und lässt Rückschlüsse auf den Stoffwechselzustand einer Kultur zu. Er wird herangezogen, um die Feedrate für die Kohlenstoffquelle zu kontrollieren oder eine bessere Balance zwischen Biomasseproduktion und der Metabolitbildung zu erzielen. Moderne Bioprozess-Software bietet standardmässig Soft-Sensoren, die die Berechnung des RQ in Echtzeit ermöglichen.

RotameterEin Nadelventil zur manuellen Steuerung des Gasvolumenstroms. Als Anzeige dient eine Stahl- oder Kunststoffkugel, die ent-sprechend des Gasvolumenstroms in einer konisch nach unten zulaufenden Röhre mit Kalibrationsskala schwebt. Anhand der Skalierung kann der Gasvolumenstrom abgelesen wird, wobei Messfehler bis zu 10 % typisch sind, insbesondere bei niedrigen Flussraten. Gase mit verschiedener Dichte benötigen eine andere Kalibrationsskala. Die Messwerte können nicht an den Control-ler weitergegeben werden und eine Änderung der eingestellten Gasvolumenstroms ist ausschliesslich händisch möglich, sodass Gasstrecken mit Rotametern nicht zur automatischen Regelung der Gelöstsauerstoffkonzentration verwendet werden können.

RührkesselreaktorEin Rührkesselreaktor (auch Stirred Tank Reactor, STR) ist ein spezieller Bioreaktorentyp mit einem Rührwerk und Impellern zum Mischen der flüssigen Phase. Dieses «traditionelle» Design wurde für die ersten Kulturen zur Antbiotikaproduktion in den 1940er Jahren eingesetzt.

Rushton-ImpellerS. Impeller

S

SCADASteht für Supervisory Control and Data Acquisition. Allgemein gesproichen handelt es um ein Computersystem für das Sammeln und Analysieren von Echtzeitdaten. Im Bereich der Biotechnologie

PhototrophGeschieht die Energiegewinnung mithilfe des Sonnenlichts, so sind die Organismen phototroph.

PID-ReglerEin Regler, der aus einem Proportional-, Integral- und Differentialteil besteht, um möglichst schnell und ohne Überschiessen den Soll-wert einzustellen. Dies wird zum Beispiel in Kaskaden eingesetzt.

Pilot-MassstabTypische Arbeitsvolumina im Pilot-Massstab reichen von 20 l bis 500 l. Im Pilotmassstab wird das Scale-Up von Produktionsprozes-sen getestet und optimiert.

pO2

S. Gelöstsauerstoffkonzentration.

PortDies ist eine Öffnung im Bioreaktor (auf dem Deckel, an der Seite oder manchmal sogar im Boden), in welche Elektroden, Gasan-schlüsse, Probenahmesysteme, Sparger oder weitere Zubehörteile angeschlossen werden können. Ein Dichtungsring oder eine flache Membran dichtet den Port ab. Wenn ein Port nicht in Benutzung ist, muss dieser mit einem Blindstopfen verschlossen werden, um Kontaminationen auszuschliessen. Die Anzahl und Grösse der Ports sind wichtige Faktoren für das Design von Bioreaktoren, da sich dadurch entscheidet, welche Extras hinzugefügt werden kön-nen. Gängige Port-Grössen sind 10 mm, 12 mm mit Pg13.5-Ge-winde, 19 mm und 25 mm.

Probenahmegerät/-systemS. Super Safe Sampler

ProduktionsmassstabDies bezieht sich im Regelfall auf Bioreaktoren grösser als 500 L, wobei die grössten Exemplare auch einige Kubikmeter umfassen können. Mit dem Einzug wertschöpfungsintensiver rekombinanter Proteine können allerdings auch schon 10 L Bioreaktoren in den Produktionsmassstab gezählt werden.

Pt100(-Sensor)S. Temperatursensor.

Q

QualifizierungEine Sammlung von Dokumenten und Testergebnissen, wel-che belegen, dass der Bioreaktor entsprechend der gegebenen Standards produziert und getestet wurde. Dies ist häufig Teil eines umfassenderen Validierungsprozesses.

sind SCADA mittlerweile Standard zur Optimierung und Überwa-chung von Bioprozessen.

SauerstoffanreicherungDieser Vorgang kann genutzt werden, um eine weitere Erhöhung der Zellzahl herbeizuführen, indem der prozentuale Sauerstoffge-halt der zum Bioreaktor zugeführten Luft durch reinen Sauerstoff erhöht wird. Dies kann beispielsweise durch eine zweite, mit einem Massendurchflussregler versehene Gasstrecke realisiert werden.

Sauerstofftransportrate(auch Oxygen Transfer Rate, OTR) beschreibt, wie effizient der Sauerstoffübergang aus den Gasblasen in das Medium des Bio-reaktors übergeht. Die Grösse der Gasblasen, die Verweildauer im Reaktor sowie die Sauerstoffsättigung bei einer bestimmten Temperatur sind massgebliche Faktoren für die Sauerstofftrans-portrate. Eine mathematische Definition erfolgt über den kLa, den volumetrischen Stoffübergangskoeffizienten, und die Sauerstoff-konzentration im eingetragenen Gasgemisch sowie der Gleich-gewichtskonzentration. Typische OTR für einen Rührkesselreaktor liegen zwischen 50–100 mmol l–1h–1.

Scale-DownDies erlaubt, die Schlüsselparameter eines Bioprozesses im grossen Massstab auf kleine Gefässe zu übertragen, indem die erhaltenen Informationen extrapoliert werden.

Scale-UpDas Aufskalieren eines Prozesses vom Labor- in den Produktions-massstab erfolgt in mehreren Schritten. Während jeder Etappe werden Faktoren wie die Handhabbarkeit, Leistungseintrag, Bega-sung, Mischzeit, Rührerdrehzahl und Temperaturkontrolle beurteilt und anhand der Grösse angepasst.

SchaumAn die Oberfläche tretende Gasbläschen aus dem Sparger als auch im Kulturmedium gelöste Proteine können während des Bioprozesses zur Schaumbildung führen. Die Zudosierung flüssi-gen Antischaummittels und/oder Nutzung eines mechanischen Schaumbrechers schaffen dort Abhilfe.

SchaumsensorEin Leitfähigkeitssensor, der zur Detektion von Schaum oberhalb der flüssigen Phase einer Kultur genutzt wird. Die Sonde ist mit einem nicht-leitenden Mantel versehen, aus dem lediglich die unbedeckte Spitze zur Schaumdetektion herausragt. Wird Schaum erkannt, wird meist ein Antischaummittel über eine Peristaltik-pumpe mit einer programmierten zeitlichen Verzögerung hin-zudosiert. Die zeitliche Verzögerung wird verwendet, um einer etwaigen Überdosierung entgegenzuwirken.

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SensorEin Messgerät, welches in den Bioreaktor hineinragt und in direk-tem Kontakt mit dem Kulturmedium steht (z.B. pH-Sensor) oder ein externes Gerät, welches indirekte Messungen unternehmen kann (z.B. Abgasanalysator).

SondeS. Sensor

SpargerEin Rohr, welches bis zum Boden des Bioreaktors gerade unterhalb des Impellers reicht, um dort Gas, typischerweise Luft einzubrin-gen. Dafür sind kleine Löcher am Ende des Spargers (oben oder unten) angebracht. Gebräuchliche Formen eines Spargers sind gebogen, ring- oder L-förmig.

Spezifische BegasungsrateDie spezifische Begasungsrate (engl. vessel volumes per minute, vvm) bezieht die Begasungsrate auf das verwendete Arbeitsvo-lumen und dient somit zum Vergleich bzw. zur Übertragung von Bioprozessen in Bioreaktoren verschiedener Massstäbe. Bioreakto-ren für mikrobielle Bioprozesse sind typischerweise für spezifische Begasungsraten bis zu 2 l l–1 min–1 oder kurz 2 min–1 ausgelegt. Ein Bioreaktor mit 10 l Arbeitsvolumen wäre somit für einen maxima-len Gasvolumenstrom von 10 l * 2 min–1 = 20 l min–1 ausgelegt. Für tierische Zellkulturen hingegen werden meist deutlich geringe-re spezifische Begasungsraten bis zu 0.1 min–1 einsetzt.

SpinfilterEin Einsatz, der insbesondere in Bioreaktoren für tierische Zellkul-turen verwendet wird. Der Spinfilter wird so an der Antriebswelle angebracht, dass stets Kulturflüssigkeit ohne den Verlust von Zellen aus dem Reaktor entnommen werden kann. Ein Gewebe, meist mit einer Maschengrösse zwischen 10 bis 30 µm, bildet einen Käfig, wo das Kulturmedium samt Produkten und Metabo-liten hindurchpasst, die Zellen jedoch nicht. Mittels Spinfilter kön-nen langsam wachsende Zellen zur Produktion von Biopharma-zeutika über ausgedehnte Perioden im Bioreaktor zurückgehalten und dort kultiviert werden, während permanent Produkt geerntet und frisches Kulturmedium nachgefüttert wird.

Stationäre PhaseEine Phase in einem typischen Wachstumsprozess einer Batch-Kul-tur, während derer sich über die Zeit die Nährstoffe erschöpfen. In dieser Phase sterben in etwa so viele Zellen wie durch Teilung neue hinzukommen, was zu einer stagnierenden Zellzahl führt. Dieses Gleichgewicht kann auf Grund des Mangels an Nährstoffen und der Ansammlung toxischer Nebenprodukte nicht dauerhaft gehal-ten werden, sodass der Bioprozess in die Absterbephase übergeht.

T

TemperatursensorZumeist eine Platinwiderstandelektrode, welche präzise Tempe-raturmessungen im Bioreaktor wie auch in den angeschlossenen Peripheriegeräten ermöglicht. Ein Pt100-Widerstand verändert gemäss der herrschenden Temperatur seinen elektrischen Wider-stand und hat bei 0 °C einen Widerstand von 100 Ω.

TemperierblockMeist aus Aluminium gefertigt, passt ein Temperierblock form-schlüssig an das zugehörige Kulturgefäss, sodass ein guter Wärmeübergang gewährleistet ist. Im Temperierblock ist ein Heizelement verbaut, mit dem die Temperatur der flüssigen Phase des Bioreaktors gesteigert werden kann. Zur Kühlung ist der Temperierblock wiederum mit Kühlschleifen durchzogen, durch die eine Kühlflüssigkeit, z.B. Wasser aus einem angeschlossenen Umlaufkühler, zirkuliert wird, um die Temperatur zu senken. Temperierblöcke kommen bei einwandigen Kulturgefässen zum Einsatz und bieten ein besseres Handling als die Kombination aus Heizmanschette und Kühlfinger.

TischbioreaktorNormalerweise werden so Bioreaktoren mit einem Arbeitsvolu-men von 0,1 bis 10 Liter Arbeitsvolumen bezeichnet.

TotalvolumenDas totale, interne Volumen eines Kulturgefässes inklusive Kopfraum.

TransferleitungEine Verbindung, um eine Kultur aus einem Gefäss ins nächste zu überführen, ohne diese dabei zu kontaminieren. Diese kann entweder als feste Rohr- oder flexible Schlauchverbindung und optional als in-situ-sterilisierbares Element ausgeführt sein.

U

Upstream-Processing (USP)Diese Teildisziplin der Bioverfahrenstechnik befasst sich mit allen Methoden, die der Anzucht und Optimierung von Organismen für den eigentlichen Bioprozess dienen. Dazu gehören Zellisolie-rung, -kultivierung, -expansion, Entwicklung/Optimierung von Inokulum, Medium und Prozessen, auch mit Hilfe genetischer Methoden.

StarterkulturBezeichnet die Herstellung einer Menge Biomasse mittels asepti-scher Arbeitsweise, welches als Inokulum für einen grösseren Bio-reaktor genutzt. Häufig sind dafür mehrere Schritte, oftmals auch im Schüttelinkubator, zwischengeschaltet, um ein hinreichend grosses Inokulum herzustellen. Erfolgt die Produktion der Star-terkultur z.B. für einen Produktionsbioreaktor in einem kleineren, vorgeschalteten Bioreaktor, so wird dieser analog zum englischen Begriff seed (Saat) oft Seed-Bioreaktor genannt.

StrömungsbrecherFlache Blätter an der Innenseite des Rührkessels (typischerweise 3 bis 4), die als Schikane für das Medium fungieren. Diese helfen, eine turbulente Strömung zu erzeugen, die flüssige Phase optimal zu durchmischen und die durch Flachblatt-Rushton-Impeller und den Sparger eingetragene Gasblasen im mikrobiellen Bioprozess zu zerkleinern.

Sterilisation-in-Place/Steam-in-Place/Sanitisation-in-Place (SIP) Für die Abkürzung SIP gibt es verschiedene Interpretationen, die alle etwas ähnliches beschreiben, sich aber dennoch in Nuancen unterscheiden. Grundsätzlich geht es darum, dass der Bioreaktor über einen Dampfanschluss verfügt und zur Sterilisation/Saniti-sierung nicht in einen Autoklaven gebracht werden muss (Steam-in-Place). Mit dem Dampf wird vor Ort eine Sanitisierung, also eine Abreicherung der Lebendkeimzahl durchgeführt (Sanitisati-on-in-Place). Wurde das Verfahren an diesem Bioreaktor validiert und nachgewiesen, dass durch den SIP-Prozess Sterilität herbeige-führt wird, spricht man auch von Sterilisation-in-Place.

In-situ-sterilisierbare Kulturgefässe bestehen für gewöhnlich aus rostfreiem Edelstahl (316L) und können mit Dampf aus der Hausversorgung oder einem in der Grundeinheit eingebauten Dampfgenerator vor Ort (in-situ) sterilisiert werden. Periphere Teile wie Filter, Probenahmegeräte und die Antriebsdichtung werden dabei ebenso sterilisiert. ISS-Bioreaktoren haben häufig Arbeitsvo-lumen über 10 L. SIP ist jedoch nicht alleine den Edelstahlbioreak-toren vorbehalten: inzwischen gibt es auch für Tischbioreaktoren Lösungen, wie zum Beispiel den LabCIP für den Labfors 5. Hier wird natürlich nicht mit Dampf gearbeitet, sondern auf chemische Methoden zurückgegriffen, da die Verwendung höherer Drücke ein Risiko für die Glas-Kulturgefässe wäre.

SubstratIn einem Bioprozess bezieht sich dieser Ausdruck zumeist auf die Kohlenstoffquelle im Feed.

Super Safe SamplerKleine Mengen einer Kultur können durch Probenahmegeräte wie dem INFORS HT Super Safe Sampler kontaminationsfrei und totvolumenarm aus dem Bioreaktor entnommen werden.

V

ValidierungEin Vorgang, mit dem sichergestellt wird, dass ein Prozess die geforderten Standards an Produktivität, Reproduzierbarkeit sowie Sicherheit erfüllt. Die Dokumentation der Qualifizierung von zum Beispiel Bioreaktoren ist ein dafür unabdingbarer Teil des Prozesses.

Volumetrischer StoffübergangskoeffizientS. kLa

VorkulturS. Starterkultur

vvmS. Spezifische Begasungsrate

Z

ZellkulturEin allgemeiner Begriff für die Kultivierung von Säugetier- und Insektenzellen.

ZelltrockenmasseDa der Flüssigkeitsgehalt von Mikroorganismen je nach Zustand variieren kann, wird zur präzisen Mengenbestimmung die Biotro-ckenmasse verwendet. Hierzu wird ein bekanntes Probenvolumen genommen ggf. in einem definierten Puffer gewachen, in einem Ofen getrocknet und anschliessend gewogen. Für die so ermittelte Biotrockenmassekonzentration kann innerhalb ähnlicher Biopro-zesse eine Korrelation zur optischen Dichte oder Trübung sowie zur Total- oder Lebendzellzahl ermittelt werden.

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Notizen

Wir bringen Leben in Ihr Labor.www.infors-ht.com

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