LABORWELT 05/2011

Zellbiologie Zellrezeptor aufNeuronen kontrolliertdas Angstempfinden

Paper des Monats: Transport-Defekt akkumuliert Alzheimerprotein

Krebszellen erkennen mit Hilfe von elektrischemZellstrecker

Expertenpanel

Sequencing

Nr. 5 / 2011 – 12. Jahrgang

laborwelt

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Editorial | InhaltEditorial | Inhalt

LABORWELT 12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 3

Expertenpanel: Next-Gen Sequencing

MiteinerneuenRubrikbeleuchtetLABORWELTvondieserAusgabeanTechnologien,aktuelleProduktentwicklungenundProbleme,mitdenensichAnwenderanderLaborbankkonfrontiertsehen.DasersteLABORWELT-„Expertenpanel“widmetsichdemNext-Generation-Sequencing,indemsichdiezunehmendeKonkurrenzderAnbietervorallembeidenDesktop-GerätendurchdramatischfallendeGerätepreisebemerkbarmacht.WelcheVorteiledieSys-temeamMarktwirklichhaben,wannDienstleisterbessersindetc.verratenvierausgewieseneExpertenabSeite23.

IndiesemHeft

Industrielle ZelltechnologieAls mit der Gründung der Firma Genentech das Biotechnologie-Zeitalter in den USA anbrach, hatten die Forscher eines im Sinn: Zellen zu nutzen, um Wirkstoffe zu produzieren. Gut dreißig Jahre später geht es darum, komplexere Aufgaben zu bewältigen: Dreidimensionale Zellkulturen und mit Stammzellen beschichtete Implantate sollen in der Regenerativen Medizin, aus Stammzellen gewonnene Zellmodelle in der Wirkstofffor-schung helfen. Die Förderung der Zusammenarbeit von Forschungslabors und Firmen hat sich die Deutsche Gesellschaft Industrielle Zelltechnologie e.V. auf die Fahnen geschrieben (vgl. Seite 30). Zusammen mit der BIO Deutschland, die die politische Interessenvertretung übernimmt, wollen sich die zehn Gründungsmitglieder für die Förderung von Nachwuchsfor-schern, die Vernetzung von Arbeitsgruppen und die Umsetzung innova-tiver Zelltechnologie-Ansätze in Produkte einsetzen. Dass es davon viele gibt, dokumentiert diese Themenausgabe „Zellbiologie“.

So haben etwa Wissenschaftler des Fraunhofer-Instituts für bio-medizinische Technik ein kosteneffizientes, einfach zu handhabendes Verfahren entwickelt, mit dem Zellen elektrisch gestreckt werden können (vgl. Seite 16). Der Zell-Stretcher soll helfen, Krebszellen anhand ihrer viskoelastischen Eigenschaften zu erkennen. Gleich zwei Gruppen berichten von Zellmodellen, die die Untersuchung der Herztoxizität von Arzneimittelkandidaten in frühem präklinischen Stadium gestatten sollen – ein Ansatz nutzt dazu die nicht-invasive Messung von aus Stammzellen differenzierten Kardiomyozyten (vgl. Seite 6). Eine andere Gruppe will mit spannungssensitiven Farbstoffen an adulten Herzzellen Veränderungen im Aktionspotential nachweisen (Seite 20). Ein dritter Themenkomplex widmet sich neuen durchflusszytometrischen Verfahren (vgl. Seite 12 und 32). Eine informative Lektüre wünscht � Thomas�Gabrielczyk

Titel: ZellbiologieEin Gen aus dem Bakterium Bacillus subtilis reduziert die Folgen von Trockenstress für Nutzpflanzen. Querschnitt durch die Leitbahnen.

Bild: BASF SE

Inhalt

Paperwelt Highlight des Monats4 Morbus Alzheimer – ein Transportproblem?

Jens Pahnke et al., Universität Rostock

Blitzlicht Arzneimittelforschung6 Physiologische Messung der Kardiotoxizität

Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg

Wissenschaft AML12 Depletion von ab-T-Lymphozyten aus peripheren Stammzellen

Rupert Handgretinger, Universitätsklinikum Tübingen

Blitzlicht Zellsortierung16 Einzelzellmessung mechanischer Eigenschaften

Magnus Jaeger et al., Fraunhofer-Institut für biomedizinische Technik, Golm

Blitzlicht Verbrauchsmaterialien19 Die wichtigsten Überlegungen bei der Auswahl von Laborhandschuhen

Jaime Cassar, Roberto Greselin, Kimberly-Clark Professional

Wissenschaft Toxizitätsscreening20 Neues zelluläres QT-Screen-Konzept mit adulten Herzmuskelzellen

Dr. Lars Kaestner, Prof. Dr. Peter Lipp, Universität des Saarlandes, Homburg

Blitzlicht Regenerative Medizin27 Standardisierung der Stammzellgewinnung und -herstellung

Dr. Andreas Emmendörffer, V-Care Biomedical GmbH, Leipzig

Wissenschaft Technologietransfer30 Zelltechnik-Innovationen für die Industrie Anja Rasch, Deutsche Gesellschaft Industrielle Zelltechnik e.V., Lübeck

Blitzlicht Analytik32 Durchflusszytometer: Kompaktklasse für Zellanalysen Jason Whalley, Merck Millipore, Billerica

Wissenschaft Neurowissenschaften35 Bidirektionale Kontrolle der Angst durch den CRH-Rezeptor Typ1

Jan M. Deussing, Florian Holsboer, MPI für Psychiatrie, München

Blitzlicht Probenvorbereitung38 RNA-Isolation aus FFPE-Gewebe: Säulchen vs. Beads

Robert Loewe, GeneWake GmbH, Neuried

26 Labormarkt im Umbruch

41 Stellenmarkt

45 Verbände

46 Produktwelt

49 Termine

50 Ausblick / Impressum

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Paperwelt Highlight des Monats

4 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011 LABORWELT

Prof. Dr. Dr. Jens Pahnke, ist Leiter des Forschungslabors für Neurodegenerative Erkrankungen (NRL) und des Maushauses am Zentrum für Nervenheilkunde der Uni-versität Rostock. Seit 2005 ist er Professor für Neurodegeneration. Vom 1. Dezember 2011 an wird er an der Universität und dem Deutschen Zentrum für Neurodegene-rative Erkrankungen in Magdeburg eine Arbeitsgruppe Translationale Forschung aufbauen. Nach Studium der Medizin und Humanbiologie an der Universität Greifs-wald und Promotion zum Dr. med. im Jahr 2000 ging Pahnke ein Jahr als Post-Doc an die Klinik für Neurologie des Zentrums für Nervenheilkunde der Universität Rostock. Danach wechselte er an das Department für Pathologie des Universitätsspitals Zürich. 2004 promovierte er zum Dr. rer. nat. im Fachgebiet Molekularbiologie. Pahnke ist Experte auf dem Gebiet der Funktion Trans-portproteinen der Blut-Hirn-Schranke, spe-zifischen mitochondrialen Mutationen und neuen Mausmodellen zur Untersuchung der Entstehung von Proteinaggregaten bei neurodegenerativen Erkrankungen.

LABORWELT:Welche Perspektiven eröffnen Ihre Ergebnisse?

Pahnke:Völlig neue. Fast alle bisherigen Ansätze kon-zentrierten sich auf die Suche nach genetischen Ursachen für Alzheimer und andere neurodege-nerative Erkrankungen. Für die familiäre Form kennt man auch drei Gene. Was die sporadische Form der Alzheimererkrankungen ausmacht, lag dagegen bislang völlig im Dunkeln. Dass ein ge-störter Transport des Amyloid-beta(Ab)-Proteins und ähnlicher Proteine aus dem Hirn die Ur-sache von Krankheiten wie Morbus Alzheimer, Parkinson oder Huntington sein könnte, eröffnet ein ganz neues Forschungsfeld. Es könnte ein grundlegender Mechanismus sein, dass Peptide über Jahre aufgrund ihres schlechten Abtrans-portes im Gehirn abgelagert werden.

LABORWELT:…und das zeigt sich dann erst mit einer zeitlichen Verzögerung im Patienten …

Pahnke:Richtig. Daten einer Gruppe aus St. Louis vom Dezember 2010 zeigen, dass in den alten Alz-heimer-Patienten der Ab-Abtransport um 30% reduziert ist. Wir haben in unserem Modell eine Veränderung von nur 11% gesehen. Das heißt, wir reden hier gar nicht über Veränderungen in großem Stil, aber trotzdem hat dies über Jahre einen Rieseneffekt. Das würde vieles erklären, zum Beispiel, warum Alzheimer schon viel früher anfängt als die Symptomatik, warum die Krankheit so langsam, aber stetig fort-schreitet und sich schließlich in Symptomen manifestiert. Wenn erst einmal eine gewisse Konzentration erreicht ist, fällt das Protein aus, und die Krankheit bricht aus.

verschwanden binnen 25 Tagen 70% bis 80% des Ab-Proteins aus dem Maushirn.

LABORWELT:Wie gehen Ihre Arbeiten jetzt weiter?

Pahnke:Als nächstes stehen die genaue Charakterisie-rung der Bindungstasche des ABCC1-Transporters für den Wirkstoff und der funktionell relevanten Polymorphismen an. Wir werden dazu den Transporter kristallisieren. Zweitens werden wir zusammen mit der Firma Immungenetics AG eine umfassende SNP-Analyse des Transporters in Alzheimerkranken durchführen. Drittens sind wir dabei, Assays zu etablieren, um die Aktivität der Transporter mit Hilfe radioaktiver Tracer mit-tels PET zu untersuchen. Man kann dann sehen, wo sich die Tracer ablagern und daraus frühzeitig Informationen erhalten, welche Krankheit da im Entstehen ist, wie eine holländische Arbeitsgrup-pe bereits zeigen konnte.

Morbus Alzheimer: ein Transportproblem?Markus Krohn, Cathleen Lange, Jacqueline Hofrichter, Katja Scheffler, Jan Stenzel, Johannes Stef-fen, Toni Schumacher, Thomas Brüning, Anne-Sophie Plath, Franziska Alfen, Anke Schmidt, Felix Winter, Katja Rateitschak, Andreas Wree, Jörg Gsponer, Lary C. Walker und Jens Pahnke. Cerebral amyloid-b proteostasis is regulated by the membrane transport protein ABCC1 in mice. Journal of Clinical Investigation 2011;121(10):3924–3931

Sind Alzheimer und andere neurodegenerative Erkrankungen auf einen mangelhaften Abtransport aggregierender Proteinspezies aus dem Hirn zurückzuführen? Arbeiten einer Gruppe um Jens Pahnke legen dies nahe. In Mausmodellen der Alzheimer-Demenz konnten sie zeigen, dass das Ausschalten des ABC-Transportproteins C1 der Blut-Hirn-Schranke zu einer 12- bis 14-fachen Akkumulation von Amyloid-beta-(Ab)Peptiden im Hirn führt. Aktivatoren des ABCC1-Transportproteins, wie der zuge-lassene Wirkstoff Thiethylperazin, bewirkten dagegen eine bis zu 75%ige Auflösung der Plaques im Mausmodell. Frühere Arbeiten, die eine 30%-ige Reduktion des Ab-Transports über die Blut-Hirn-Schranke in alten Alzheimer-Patienten zeigen, stützen die These, dass Alzheimer die Folge einer schleichenden Akkumulation „klebriger“ Peptide infolge ihres gestörten Abtransportes ist.

LABORWELT:Was brachte Sie auf die Idee, dass Transport-proteine der Blut-Hirn-Schranke an der Ent-stehung von Alzheimer beteiligt sind?

Pahnke:Zwei Dinge. Zum einen Arbeiten in der Phar-makologie, die ABC-Transportproteine unter-suchen, weil sie eine Rolle beim Abtransport von Krebs-Chemotherapeutika aus Krebszellen spielen. Die Transporter sind in Krebszellen so hochexprimiert, dass diese Chemotherapie-resistent werden. Zweitens, veröffentlichte im Jahr 2001 eine kanadische Arbeitsgruppe Ergebnisse, die darauf hindeuteten, dass der ABCB1-Transporter auch Ab transportieren könnte. Das war 2004 der Ausgangspunkt für uns. Wir haben in Gehirnen von alten Alzheimer-Patienten geschaut, ob dieser Transporter eventuell weniger aktiv ist als in Gesunden, und genau das war der Fall. Dann habe ich mit Mausexperimenten und der Erzeugung entsprechender Defektmutanten für ABC-Transporter angefangen.

LABORWELT:Aktuell haben Sie sich ganz gezielt die Transport-proteine der Blut-Hirn-Schranke angeschaut…

Pahnke:Wir haben drei der zehn Transporter in knock out-Mäusen angeschaut, ABCB1, von dem wir bereits wussten, dass er Ab transportiert, und als Kontrollen ABCC1 und ABCG2. Das Ergebnis hat uns sehr überrascht. Denn zwar war die Ab-Konzentration in ABCB1-Mutanten um das 3,5 bis 4-Fache erhöht, in ABCC1-Mutanten fanden wir aber eine 12- bis 14-fache Erhö-hung. Aktivierten wir den ABCC1-Transporter mit dem seit den 60er Jahren marktzuge-lassenen Anti-Brechmittel Thiethylperazin

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Blitzlicht Arzneimittelforschung

Physiologische Messung der KardiotoxizitätDr. Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg

Die Kardiotoxizität von Substanzen ist ein Hauptgrund für das Scheitern von Arzneimittelkandidaten. Die nicht-invasive Messung der Impedanzänderung schlagender Kardiomyozyten nach Applikation von Wirkstoffen eröffnet die automatisierte und frühe Beurteilung der Kardiotoxizität im For-schungsstadium der Medikamentenentwicklung. Mit Hilfe von aus embryonalen Mausstammzellen differenzierten Kardiomyozyten gelang es Abbassi et al.1 unlängst, Arrhythmie-assoziierte Dosis-Antwort-Profile von 60 Substanzen mit Hilfe des xCELLigence Cardio Instrumentes (Roche Applied Science, Penzberg) sensitiv und quantitativ zu erfassen, die wegen ihrer kardiotoxischen Wirkungen vom Markt genommen worden waren – darunter Ionenkanalmodulatoren, Chrono-/ionotrope Substanzen, hERG-Kanal-Blocker und Induktoren von Torsages-de-Pointes-Arrhythmien. Auf Basis der ermittelten Profile gelang es den Forschern, auch andere proarhythmogene Modulatoren der Herzfunktion zu erkennen, auch solche die mit elekrophysiologischen Messungen nicht erfasst werden können. Als Vorteil des eingesetzten Systems sehen die Autoren, dass die Kardiotoxizität in hohem Durchsatz an ganzen Zellen erfasst wird, was die physiologische Situation eher wiedergibt als die isolierte Betrachtung einzelner Ionenkanäle.

Abb. 2: E-Plate für die Echtzeit-Impedanz-messung

Substanzen aus verschiedenartigsten Stoffklas-sen sind aufgrund kardiotoxischer Nebenwir-kungen vom Arzneimittelmarkt verschwunden. Zwischen 1990 und 2006 waren ventrikuläre Arythmien – sogenannte Torsades-de Pointes (TdP) – für das Zurückziehen rund ein Drittel aller Arzneien verantwortlich. Dazu kommt das Scheitern vieler Projekte im Tierversuchs-stadium. Deshalb gibt es einen hohen Bedarf an Assays, die kardiotoxische Effekte bereits im frühen vorklinischen Entwicklungsstadium verlässlich nachweisen.

Bisher fehlt noch ein prädiktives, biologisch relevantes Modellsystem für das Screening kardiotoxischer und proarrhythmogener Wirkungen für den Einsatz während der Hit-to-Lead- oder Lead-Optimierungs-Phase2. Ob-wohl grundsätzlich primäre Kardiomyozyten aus Nagern und dem Menschen für die frühe Abschätzung der Herztoxizität von Substanzen

eingesetzt werden können, hat die technische Schwierigkeit, ausreichende Mengen dieser Zellen in hoher Qualität zu erhalten, ihrer breiten Anwendung bisher entgegengestan-den3. Stattdessen dient die Messung der Interaktion des heterolog exprimierten hERG-Kanals mit Substanzen als Surrogatmarker für TdP-Arrhythmien. Direktere Methoden setzen ganze Tierherzen oder Purkinje-Fasern ein, um die Länge von Aktionspotentialen zu ermit-teln4. Sie weisen aber Limitationen bezüglich des Durchsatzes und einer technisch einfach handzuhabenden Umsetzung auf.

Aktuelle Fortschritte bei der Differenzierung embryonaler oder induziert-pluripotenter Stammzellen schaffen nun die Grundlage für die Etablierung physiologisch und krankheits-relevanter Modellsysteme für die präklinische Prüfung der Sicherheit von Substanzen2,3,5,6,7. Die Möglichkeit, selektiv Zelltypen wie etwa

Kardiomyozyten zu differenzieren, verbunden mit der Möglichkeit Stammzellen genetisch so zu verändern, dass sich daraus differenzierte Phänotypen anreichern lassen, bietet einen vielversprechenden Ansatz für die toxikologi-sche Forschung.

In einer aktuellen Publikation haben Abbassi et al.1 das Potential Stammzell-abgeleiteter Kar-diomyozyten für die Sicherheitsüberprüfung vor-klinischer Arzneimittelkandidaten mit Hilfe des xCELLigence Cardio Instrumentes überprüft. Das System gestattet die nicht-invasive Messung des rhythmischen Schlagverhaltens dieser Zellen anhand der Impedanzänderung adhärenter Zel-len in einer speziellen 96-Well-Platte (E-Plate), an deren Boden sich Mikroelektroden befinden. Mit Hilfe von aus Mausstammzellen differenzierten Kardiomyozyten (mESCCs) gelang es mit dem System, die Effekte von Ionenkanalmodulatoren und anderen Modulatoren der Herzfunktion zu erfassen. Auch komplexe Mechanismen, wie Arrhythmien, die sich auf eine Inhibition des Proteintraffickings zurückführen lassen, konnten durch Langzeitmessungen mit dem XCELLigence Cardio Instrument erfasst werden.

Methoden

Zellkultur: Aus Maus-ES-Zellen abgeleitete Kar-diomyozyten (Cor.At) wurden von Axiogenesis (Köln) erhalten und mit leichten Modifikationen gemäß Herstellerprotokoll behandelt. Jede Vertiefung der E-Plate wurde mit 50 µl einer 1:100-verdünnten Fibronectin-Lösung (F1114, Sigma Aldrich, St. Louis) beschichtet und bei 4 °C über Nacht inkubiert. Nach Entfernen des Fibronectins wurden die Wells mit PBS gewa-schen und die Zellen ausgesät. Dazu wurden die in Stickstoff gelagerten Zellen bei 37 °C in einem Wasserbad angetaut, in ein konisches 15mL-Röhrchen mit 9 mL Cor.At Complete Culture Medium gegeben (CXAM-250E, Lonza, Köln), 5 Min. bei 100g zentrifugiert und in einem klei-nen Volumen Medium mit 10 µg/ml Puromycin resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt und der Anteil lebender Zellen mit der Trypan-Blau-Methode bestimmt. Alle chemischen Reagen-zien wurden von Sigma Aldrich (St. Louis) oder Tocris (Ellisville) bezogen.Abb. 1: Roches automatisiertes System zur Echtzeitüberwachung schlagender Herzzellen

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ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden. Dieses kann durch die Anwesenheit adhären-ter Zellen beeinträchtigt werden. Dabei ist das Ausmaß der Impendanzänderung proportional zu der ausgesäten Zellzahl, der Zellmorpho-logie und der Beschaffenheit der Anheftung. Da die Kontraktion von Kardiomyozyten mit einer zyklischen Veränderung der Zelladhäsion und Morphologie einhergeht, kann die Impe-danztechnologie angewandt werden, um die Kardiomyozyten-Kontraktion zu erfassen.

Abb. 3: Dynamische Überwachung und Charakterisierung von schlagenden mESCCs mittels Impedanz-basierter Detektion [aus 1]. A. Schema der geteilten Gold-Mikroelektroden der E-Plate. Das Anlegen einer niedrigen Wechselspannung erzeugt ein elektrisches Feld das von den adhärenten Kardiomyocyten beeinflusst wird. B. Schlagverhalten von mESCCs zu bestimmten Zeiten nach Zellaussaat im xCELLigence Cardio System. Die Schlagrate (1/min), -amplitude (D CI), Schlagdauer (IBD50; ms), Zeit bis zum Maximum (ms) and Abklingzeit (ms) wurden mittels xCELLigence Cardio-Software quantifiziert. Mittelwert aus 8 Wells ± Standardabweichung. C. Messung mit xCELLi-gence Cardio System: Schlagverhalten nach Zugabe von Blebbistatin. D. Messung des Effektes von Blebbistatin auf mESCC mittels Multi-Electrode Arrays: Kein Effekt ist sichtbar.

Monitoring der Kardiomyozyten-Anheftung und -Kontraktion

Zwischen 40.000 und 60.000 lebende Zellen wurden in je eine Vertiefung einer 96-Well-E-plate (Roche Applied Science, Penzberg/ACEA Biosciences, San Diego) gesät. Die Zellen wurden mit dem xCELLigence Cardio System überwacht. Das Zellkulturmedium wurde täglich gewechselt. Im Allgemeinen wurde die Behandlung mit Wirkstoffen 60 bis 80 Stunden nach dem Aussäen begonnen, abhängig von der Dichte des Zellrasens. Die Datenerfassung erfolgte mittels eines Soft-wareprogrammes, das die Hardware steuert und es gestattet, die Abtastfrequenz und das Abtastfenster zu definieren. Abtastfrequenz ist dabei definiert als der Zeitraum, der zwi-schen zwei Messungen verstreicht, Abtast-fenster ist die Zeit einer Einzelmessung. Vor Substanzzugabe betrug die Abtastfrequenz normalerweise 1 h und das Abtastfenster 20 s; 5 Minuten vor Beginn der Behandlung wurden die Zellen jede Minute einmal für 20 s abgetastet, um eine Basislinie aufzuzeichnen. Nach Substanzzugabe betrug die Abtastfre-quenz in den ersten 60 Min. 1 Minute, in der zweiten Stunde 5 Min. und nach 3 bis 24h 15 Min. bei einem Abtastfenster von je 20s. Nach der Datenerfassung wurde die Software genutzt, um Parameter wie die Schlagrate, Amplitude, Schlagperiode, normalisierte Schlagrate, normalisierte Amplitude und den Schlagfrequenz-Abweichungs-Index (BRI) so-wie statistische Parameter und EC50-Werte für die Dosis/Antwort-Testung zu errechnen.

Begriffs- und Parameterdefinition

Jeder gemessene Schlagzyklus entspricht der Kopplung von Erregung und Kontraktion der Kardiomyozyten (Abb. 2C). Die Schläge wer-den als Abfolge positiver (P+) und negativer (P–) Peaks dargestellt. Die Zellindex-Differenz zwischen P+ und dem nachfolgenden P– wird als Amplitude bezeichnet. Die Zeit zwischen jedem P+ heißt Schlagperiode, und die Schlagrate (Schläge/min) wird aus vielen Schlagperioden berechnet. Drei Parameter beschreiben die zeitliche Schlagcharakteristik: die Anstiegszeit Tr, die Abklingzeit Td und die Halb-Amplitudenweite TIBD50. Bei der Daten-analyse werden die Parameter für jeden Schlag eines Messzyklus berechnet und die mittlere und Standardabweichung abgeleitet. Um die Wirkung von Substanzen zu vergleichen, wurden die Schlagrate oder Amplitude nach Behandlung mit dem gleichen Zeitwert vor Behandlung normalisiert. Um das Ausmaß der Arrhythmie zu bestimmen, wurde der BRI

abgeleitet, und zwar auf Basis des Variations-koeffizienten der Schlagperiode während einer Aufzeichnungsperiode.

Mikrolelektronische Überwachung des Schlagverhaltens der Kardiomyozyten

In der Präsenz von Zellkulturmedien und nach Anlegen einer geringen Spannung an den Gold-Mikroelektroden im Boden einer E-Plate entsteht

© modifiziert, aus Brit. J. Pharmacol.1

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Ineinandergreifende Gold-Mikroelektroden

Stundennach

Kultivierung (h)

Schlagdauer(ms)

Zeit bisMaximum

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(ms)

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Schlagfre-quenz (1/min ± Standard-

abweichung)N=8

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Kontrolle 10mM Blebbistatin


LABORWELT

Für entsprechende Bestimmungen wurden 40.000 mESCCs pro Well ausgesät und bis zu 96 Stunden lang in Kultur beobachtet. Das Schlagverhalten wurde nach 12, 24, 48, 72 und 96 Stunden für jeweils 20 s aufgezeichnet. Interessanterweise zeigte sich bis 24 Stunden nach Aussäen keine gleichmäßige Schlagak-tivität, obgleich mikroskopisch Haufen asyn-chron schlagender Kardiomyozyten detektiert werden konnten, die noch kein Synzytikum gebildet hatten. Nach 48 Stunden begannen die Zellcluster Verbindungen auszubilden und die Einzellschicht am Grunde der Vertiefung synchron zu schlagen. Zugleich konnte mittels Impedanzmessung zu diesem Zeitpunkt eine reproduzierbare Schlagaktivität gemessen werden (Abb. 2B). Die Schlagfrequenz betrug nach 48 Stunden 80 Schläge/Minute und nahm während der Kultivierung kontinuierlich zu, bis nach einem Monat in Kultur eine Schlagrate von 250 Schlägen/Minute erreicht wurde. Diese Be-obachtungen decken sich mit elektrophysiologi-schen Messungen der Dauer von Aktionspoten-tialen in aus embryonalen Mausstammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten10.

Um die Schagaktivität quantiativ zu erfas-sen wurden die drei Parameter Anstiegszeit Tr, Abklingzeit Td und Halb-Amplitudenweite TIBD50 abgeleitet. Der TIBD50 -Wert von 142±4,6 ms nach 48 Stunden sank auf 105±2,4 ms nach 96 Stunden (Abb. 2B). Der als Tr bezeichnete Anstieg der Amplitude reichte von 29±5,1 ms bis 38±1,4 ms. Die Abklingzeit Td, die die Zeit wiedergibt, die verstreicht, bis das Signal von 80% auf 20% der Peakhöhe abgenommen hat, war länger als Tr und lag zwischen 88±7,2 ms und 124±12 ms (Abb. 2B). Die Kinetik des Anstiegs und Abfallens verhielt sich analog zu jener von Calcium in embryonalen Maus-Kardiomyozyten11, was auf einen Zusammenhang mit den beiden Phasen des Schlagzyklus, Kontraktion und Relaxation, hindeutet.

Um dies zu überprüfen, setzten Abbassi et al.1 Blebbistatin ein, einen Inhibitor der ATPase-Aktivität der schweren Myosinkette, der die Kardiomyozyten-Kontraktion hemmt12. Es zeigte sich eine anhaltende Inhibition des Im-pedanzsignals (Abb. 2C). Die Impedanzmessung erwies sich somit als grundsätzlich geeignet, die Wirkung von Substanzen zu erfassen, die die Anregung und Kontraktion voneinander entkoppeln.

Messung der Substanzwirkung

Um die Effekte verschiedener pharmakolo-gischer Modulatoren der Schlagaktivität zu überprüfen, wurden mESCCs für drei Tage in den Vertiefungen des xCELLigence Cardio Instrumentes kultiviert. Nach Behandlung mit ansteigenden Konzentrationen von Mo-dulatoren der Na+-, K+, und Ca2+-Kanalaktivität und kanalunabhängig wirkenden Modulatoren wurde die Impedanz über 24 Stunden mit dem xCELLigence Cardio System verfolgt.

Spannungsgesteuerte Calcium-Kanäle: Von embryonalen Stammzellen abgeleitete Kardio-myozyten kontrahieren infolge intrazellulärer, hauptsächlich durch das Sarcoplasmatische Reticulum vermittelte Ca2+-Oszillationen spontan13. Das Auffüllen der Ca2+-Pools des Sarcoplasmatischen Reticulums wird wahr-scheinlich durch einen spannungsaktivierten Ca2+-Einstrom kompensiert11.

Die Zugabe von Isradipin, einem span-nungsaktivierten L-Typ-Ca2+-Kanalblocker, zu mESCCs führte zu einer mit der Zeit zunehmenden, dosisabhängigen Abnahme und Hemmung der Schlagaktivität. Die halbmaximale Dosis-Antwort auf Basis der normalisierten Schlagrate und Amplitude lag 5 min nach Substanzzugabe bei 20 nM bzw. 43,2 nM (Tab. 1): Diese Werte sind konsistent mit Daten die für isoliertes Kaninchenherz und mit rekombinanten HEK-293-Zellen, die den humanen Cav1.2-Kanal exprimieren, ermittelt wurden14,15.

Tests mit Bay K8644, einem Agonisten span-nunggesteuerter Ca2+-Kanäle, resultierten in einer über 12 Stunden erhöhten Schlagrate, die im Einklang mit der für Rattenmyozyten beschriebenen chronotropen Wirkung der Substanz und dem erhaltenen EC50-Wert von 77nM ist (Tab. 1).

Kalium-Kanal-Modulatoren: Beim Test von Chromanol 293B, einem Inhibitor des verzöger-ten aktivierenden K+-Ausstroms, zeigte sich bei einer Dosis von 100 µM eine vollständige Hem-mung der Schlagaktivität. Bei Konzentrationen von 25 µM und 3 µM zeigte sich dagegen eine Verlangsamung der Schlagfrequenz (69% bzw. 80% vgl. mit Kontrolle) und eine Verlängerung der Schlagdauer, die im Einklang zu publizierten Daten steht16.

ERG-Kanal-Inhibitoren wie E4031 zeigten ein charakteristisches Bild bei der Impedanz-messung mit dem xCELLigence Cardio System: Bei hohen Konzentrationen (200-800 nM) war der normale Schlagrhythmus unterbrochen, und eine verlängerte Schlagdauer wurde von Plateau-Oszillationen begleitet. Die ermittel-ten IC50-Werte von 27 bzw. 57 nM (Tab. 1) stehen im Einklang mit Werten, die mit der Patch Clamp-Technik an aus humanen Stammzel-len abgeleiteten Kardiomyozyten gewonnen wurden17.

Natrium-Kanal-Modulatoren: Spannungsab-hängige Na+-Kanäle sind hauptsächlich verant-wortlich für den Na+-Strom und die Depolarisie-rungsphase des kardialen Aktionspotentials. In mESCCs ist dafür nach elektrophysiologischen und Expressionsdaten das SCN5-Genprodukt zuständig. Hemmung von mESCCs mit dem Na+-Kanal-Inhibitor Tetrodotoxin führte er-wartungsgemäß zu einer dosisabhängigen Abnahme der Schlagfrequenz, die bei höheren Konzentrationen über die gesamte Messzeit er-halten blieb. Der halbmaximale Dosis-Antwort-Wert lag bei 0,28 µM.

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Chronotrope Modulatoren: Die Aktivierung des sympathischen Nervensystems und die neuro-hormonelle Regulation über den b-adrenergen Rezeptor ist ein Hauptmechanismus, um die Schlagrate und Kontraktilität des Herzgewebes zu steuern. Da sämtliche Proteine, die für eine Antwort auf ein Signal des b-adrenergen Re-zeptors erforderlich sind, in mESCCs exprimiert werden, untersuchten Abassi et al.1 auch, ob die Wirkung chrono- und ionotroper Stimulatoren mit dem xCELLigence Cardio System erfasst werden kann.

Behandlung mit Isoproterenol, einem Ago-nisten, erhöhte dosis- und zeitabhängig die Kontraktionsfrequenz der mESCCs, verkürzte aber die Gesamtdauer eines Schlages. Die Wirkung ähnelte jener des L-Typ-Ca2+-Kanal-Agonisten Bay K8644, was im Einklang zu der Tatsache steht, dass die Stimulation des b-adrenergen Rezeptors zur Aktivierung von L-Typ-Ca2+-Kanälen führt. Die Impedanzmes-sung bietet hier einen sensitiven Readout für die Bestimmung pharmakologischer Wirkungen, die die elektrophysiologischen beziehungsweise kontraktilen Eigenschaften von Kardiomyozyten verändern.

Messung des kardiotoxischen Nebenwirkungsprofils

Um die Eignung des xCELLigence Cardio Sys-tems für die Sicherheitstestung in der kardialen Grundlagenforschung und Medikamentenfor-schung zu überprüfen, führten Abbassi et al.1 zwei, einander ergänzende Untersuchungen durch. Zunächst wurden vier TdP-induzierende, vom Markt zurückgezogene hERG-Kanal-Inhibitoren mit mESCCs gescreent und deren pro arrhythmogene Parameter quantitativ er-fasst. Zudem wurden die Dosis-Antwort-Profile von 50 arrhythmogenen Substanzen mittels Echtzeit-Impedanz-Messungen bestimmt, um eine Basis für Vorhersagen kardiotoxischer Wirkungen zu etablieren.

Die Untersuchung der hERG-Hemmstoffe mit dem xCELLigence Cardio System lieferte ähnliche Daten wie schon für den K+-Kanal-Blocker E4031 hinsichtlich Kurvenform und BRI (Beating rhythm irregularity), was auf einen gemeinsamen Mechanismus hindeutet.

Abassi et al. deuten das Auftreten von Plateau-Oszillationen als Effekt früher Nach-Depolari-sationen, die über den blockierten hERG-Strom zur vorzeitigen Aktivierung spannungsabhän-giger Ca2+-Kanäle und einen Ca2+-Einstrom führen. Die mit dem System auf Basis des kinetischen Parameters BRI bestimmten halb-maximalen Hemmkonzentrationen für E4031 (57 nM), Astemizol (290 nM), Cisaprid (2700 nM), Droperid (2100 nM) und Sertindol (290 nM) befanden sich im Bereich von Bestimmun-gen, die mit elektrophysiologischen Methoden erzielt wurden15. Mit Patch Clamp-Ableitungen erzielte IC50-Bestimmungen liegen dagegen niedriger16-17, was Abassi mit Unterschieden in der Medienzusammensetzung erklärt.

Neben den kardialen Wirkungen der hERG-Kanal-Modulatoren wurden die Effekte 50 weiterer pro- und antiarrhythmogener Sub-stanzen mit dem xCELLigence Cardio System bei einer Dosis von jeweils 10, 1 und 0,1 µM bestimmt.

Bestimmung von Kurz- und Langzeit-Schäden

Die Qualität eines in vitro-Assays, der auf die Mo-dellierung des Auftretens kardialer Wirkungen in vivo abzielt, zeigt sich oft erst in dessen Fähig-keit, komplexe, herztoxische Eigenschaften zu erfassen, die über die Identifizierung einfacher Arrhythmien hinausgehen. Das Chemothera-peutikum Doxorubicin etwa induziert nicht nur Arrhythmien, sondern interferiert auch mit der Mitochondrienfunktion. Messungen an mESCCs zeigten hier eine zeit- und dosisabhängige Ab-nahme der Impedanz, den Abbassi et al. auf den Viabilitätsverlust der Zellen zurückführen. Die detektierten Impedanzmuster zeigten zudem Eigenschaften von Substanzen, die Arrhythmien induzieren.

Fazit

Das vorgestellte Verfahren erscheint im Hinblick auf seine Anwendung mit Stamm-zellen oder primären Zellen grundsätzlich geeignet, die Kardiotoxizität von Substanzen automatisiert zu erfassen und existierende

Verfahren zu komplementieren. Als Vorteil zu Methoden, die Wirkungen von Substanzen auf einzelne Ionenkanäle als Surrogatmarker der Herztoxizität erfassen, steht mit der Messung ganzer Zellen ein physiologisches Modell zur Verfügung. Die Impedanzmessung an aus Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten kann in der pharmakologischen Forschung eingesetzt werden:I um Modulatoren von Natrium-, Calcium- und

Kaliumkanälen zu identifizieren,I um direkte hERG-Kanal-Inhibitoren zu detek-

tieren,I um Modulatoren der Interaktion mit Zellre-

zeptoren nachzuweisen,I um Inhibitoren des ERG-Kanal-Traffickings

aufzudecken,I um Inhibitoren der Schlagperiodizität sowie

des Langzeitüberlebens, wie Doxorubicin, zu identifizieren und

I um Substanzen nachzuweisen, die die Kon-traktilität beeinträchtigen, aber nicht mit elektrophysiologischen Verfahren nachweis-bar sind.

Verblindete Studien an einer großen Anzahl von Substanzen sind nun erforderlich, um die Vorhersagekraft und Übertragbarkeit des hier vorgestellten Assays auf die in vivo-Situation beim Menschen kritisch zu prüfen.

Literatur

[1] Abassi YA, Xi B, Li N, Ouyang W, Seiler A, Watzele M, Kettenho-fen R, Bohlen H, Ehlich A, Kolossov E, Wang X, Xu X. (2011) Br J Pharmacol. doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01623.x.

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Christoffels VM, Moorman AF, et al. (2003). Cardiovasc Res 58(2): 399 409.

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[14] Mellemkjaer S, Bang L, Nielsen Kudsk F (1992). IPharmacol Toxicol 70(5 Pt 1): 366 372.

[15] Balasubramanian B, Imredy JP, Kim D, Penniman J, Lagrutta A, Salata JJ (2009). J Pharmacol Toxicol Methods 59(2): 62 72.

[16] Volders PG, Stengl M, van Opstal JM, Gerlach U, Spatjens RL, Beekman JD, et al. (2003). Circulation 107(21): 2753 2760.

[17] Peng S, Lacerda AE, Kirsch GE, Brown AM, Bruening Wright A T., J Pharmacol Toxicol Methods 61(3): 277 286.

Korrespondenzadresse

Dr. Burkhard Ziebolz Roche Applied Science [email protected]

Substanz Normalisierte Schlagrate [IC50/µM]

Normalisierte Amplitude [IC50/µM]

Schlagdauer[IC50/µM]

BRI [IC50/µM]

Isradapine 0.02 0.04 N.A. N.A.

(S)-(-)BayK8644 0.08 N.A. N.A. 0.024

Chromanol 293B 29 28 N.A. 30

E4031 0.027 N.A. 0.24 0.057

Tetrodotoxin 0.28 0.053 N.A. N.A.

Isoproterenol 0.014 N.A. 0.007 N.A.

Tab. 1: Quantitative Parameter der Schlagchakteristika von mESCCs. Alle Parameter wurden 5 Min. nach Substanzzugabe erfasst. Erklärung siehe Text.


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Depletion von ab-T-Lymphozyten aus peripheren StammzellenProf. Dr. Rupert Handgretinger, Universitätsklinikum Tübingen

Die allogene Stammzelltransplantation gewinnt eine neue Qualität. Grund dafür ist der Diagnostikgewinn durch die moderne Durchflusszytometrie, die eine gezieltere Auswahl der Zellen des Transplantats erlaubt. Bei der allogenen Stammzelltransplantation müssen wir die Schwierigkeit bewältigen, Spender mit immunologisch passendem HLAProfil zu finden oder die verfügbaren Transplantate für eine erfolgversprechende Transplantation so zu manipulieren, dass Komplikationen wie die Graft versus Host Disease (GvHD) gemildert werden. Die im folgenden dargestellte Studie1 soll dazu beitragen, hierfür bessere Lösungen zu finden. Forschungsziel war es, eine Methode für die klinische, großmaßstäbliche Depletion von abTLymphozyten aus mobilisierten peripheren Stammzellen zu entwickeln und so allogene Transplantate zu erhalten, die mit Stammzellen, Natürlichen Killerzellen (NKZellen) und gdTLymphozyten angereichert sind.

30 Min. inkubiert, zweimal mit CliniMACS-Puf-ferlösung gewaschen (Miltenyi Biotec, Auburn, CA USA) in 300 mL Pufferlösung resuspendiert. Zum Schluss haben wir sie im automatisierten CliniMACS-Gerät (Miltenyi Biotec) mit LS/TS (162.01)-Trennsäulen unter Verwendung des Programms Depletion 2.1 entsprechend Her-stelleranweisungen aufgetrennt.

Durchflusszytometrische Analyse

Vor und nach der ab-T-Zelldepletion haben wir das Auftreten der Oberflächenmarker CD3, CD14, CD19, CD20, CD56, CD133, CD34 und der T-Zellrezeptoren ab und gd untersucht. Eingesetzt wurde hierzu ein LSR-Durchflusszytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) . Mit folgender Methode haben wir das Produkt auf verbliebene T-Zellrezeptor-ab-Zellen geprüft: Eine Mischung der an den ab-T-Zellrezeptor gekoppelten Farbstoffe Fluorescein-Isothio-cyanat (FITC) (BMA 031; Caltag Laboratories, Burlingame, CA USA) und Phycoerythrin (11F2; BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA), an den CD45-Rezeptor gekoppeltes PE-TR (J33; Coulter/ Immuntech Co., Miami, FL, USA), an den CD3-Rezeptor konjugiertes APC (SK7; BD Biosciences Pharmingen) sowie an CD14 gebundendes APC-CY7 (MoP9; BD Bioscien-ces Pharmingen) wurde in 5-ml Prüfröhrchen gegeben. Nach Zugabe von etwa 106 Zellen in jedes Prüfröhrchen inkubierten wir diese für 10 Min. bei Zimmertemperatur im Dunkeln. Dann wurden verbliebene Erythrozyten (RBK) mit 3 mL Ammoniumchloridlösung lysiert, zentrifu-giert und einmal mit färbender Pufferlösung (Dulbecco‘s PBS, enthält 1% hitzeinaktiviertes FKS) und 0,01% NaN3, behandelt. Zur Unter-scheidung abgestorbener Zellen wurden 50 µl einer auf eine Konzentration von 1 µg/ml eingestellten DAPI (4′,6-Diamidin-2-Phenylindol, Dihydrochlorid, Molekularproben, Eugene, OR, USA)-Lösung hinzugefügt. Gesammelt haben wir die Datensätze mittels eines BD LSR II (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), der mit drei Lasern ausgestattet ist. Die Ergebnisse der Prüfröhrchen – jedes mit 1x105 bis 1x106 Frisch-zellen – wurden mittels BD FACS Diva-Software (Becton Dickinson) analysiert. Da die gleichen Antikörper zur Depletion (Clone BMA031) und zur Erkennung von ab-T-Zellen nach Depletion verwendet wurden, haben wir weitere anti-ab-Antikörper (Clone WT31; Becton-Dickinson) zur Erkennung der nach der Depletion verbleiben-den T-Zellen eingesetzt.

Funktionelle in vivo- und in vitro-Experimente

Kolonieexperimente: Nach der Depletion haben wir die in vitro-Funktionalität der Stammzellen mittels Kolonieexperimenten geprüft. Somit konnten wir die Anteile an CD133+ in den Zellen vor der Depletion und im depletierten Produkt

Gängiges Verfahren bei der Stammzelltrans-plantation ist die T-Zelldepletion mit Hilfe von Antikörpern, die gegen T-Zell-Oberflächenan-tigene gerichtet sind. Derzeit ist hierfür die Positiv selektion von Stammzellen mit dem CD34-Marker eine weitverbreitete Methode. Die Transplantation dieser Zellen kann allerdings lebensbedrohliche Virus- und Pilzinfektionen sowie Leukämierückfälle begünstigen. Denn die Positivselektion von CD34+-Stammzellen führt zwar zu einer ausgezeichneten T-Zelldepletion, entfernt aber andere, immunologisch nützliche Zellen, insbesondere Natürliche Killerzellen (NK-Zellen).

Die im folgenden beschriebenen Unter-suchungen dienen der Entwicklung eines optimierten Depletionsverfahrens, das den Kreis der möglichen Spender und Zellquellen erweitert und darüber hinaus durch bessere Selektion mehr hilfreiche Zellarten im Trans-plantat belässt.

Mobilisierung und Gewinnung von peripheren Blutstammzellen

Hierfür haben wir sieben Großversuche durch-geführt. Im ersten Arm wurden „nicht-mobi-lisierte“ periphere Blutstammzellen (PBSCs) mittels Leukapherese aus drei gesunden er-wachsenen Freiwilligen gewonnen, im zweiten Arm aus vier „mobilisierten“, gesunden, freiwil-ligen erwachsenen Spendern nach täglicher subkutaner Injektion von G-CSF (10 µg pro kg Körpergewicht, bei einer Maximaldosis von 480 µg/pro Tag; Neupogen; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) für vier Tage. Eine Leukapherese

wurde am fünften Tag unter Anwendung eines Cobra Spectra Cell Separators (Cobe, Lakewood, CO, USA) durchgeführt.

Depletion von ab-T-Zellen

PBSC wurden mit der gleichen Menge auto-logen Plasmas vermischt und über Nacht bei 4°C gelagert. Dann wurden diese Zellen (7 x 109

Gesamtzellzahl) einmal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen (PBS unter Zusatz von 1 mM EDTA) und mit 1 ml Biotin-konjugier-tem (BMA031-biotin; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) anti-ab-Antikörper für 30 Min. bei 4°C inkubiert. Anschließend wur-den die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 7,5 mL anti-Biotin an magnetische Micro Beads (Miltenyi Biotec) gekoppelt. Unter ständigem Schütteln wurden die an die Beads konjugierten Zellen bei Zimmertemperatur für

Abb. 1: Einfluss der Kopplung von abTZellen an Magnetkügelchen auf deren Depletion. Nähreres siehe Text.

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bestimmen. Sie wurden auf dieselbe Anzahl von CD133+ angepasst. Des Weiteren isolierten wir CD133+-Stammzellen aus den mononukleären Zellen (mononuclear cells, MNC) vor Depletion mittels des CD133-Selektionssatzes (Selection kit, Miltenyi Biotec) und AutoMacs (Miltenyi Bio-tec). Die Zellen wurden in einer Konzentration mit dem Äquivalent von 1.000 CD133+ pro Platte in einem Methylcellulose-basierten, halbfesten Kulturmedium (Methocult H4433; Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) ausplattiert. Nach 14 Tagen konnten die Kolonien ausgezählt und die Anwesenheit von Erythroid Burst For-ming Units (BFU-E), Erythroid Colony Forming Units Granulozyten-Macrophage- (CFU-GM) und Erythroid Colony Forming Units Macropha-ge (CFU-M) quantifiziert werden. Alle Experi-mente haben wir dreifach wiederholt.

In vivo-Engraftment-Studien: Die in vivo-Engraftment-Kapazität der αβ-depletierten, mobilisierten Stammzellen wurde jüngst im NOD-scid IL2rnull-Modell beschrieben. Dieses Modell haben wir für unsere weitere Untersu-chung genutzt. In Kürze: NOD-scid IL2rnull-Zellen wurden mit 325 cGy unter Verwendung eines 137Cäsium-Isotops (J. L. Shepard & Associates, San Fran Fernando, CA, USA) bestrahlt. Für die Transplantation werden Mäusen Zellen intra-venös in eine Querader des Schwanzes injiziert – entweder mit αβ-T-Zell-depletierten Zellen, die auf insgesamt 1x 106 CD133-Zellen angepasst wurden, oder mit 1x 106 CD133+-Positivselektion

mononukleärer Zellen vor der Depletion. Die Mäuse wurden nach acht Wochen getötet und auf menschliche Zellen in Knochenmark, Milz, Thymus und peripherem Blut untersucht. Das menschliche Engraftment hatten wir durch Doppelfärbung der Zellen mit einem Anti-Human-CD45- und Anti-Maus-CD45-Antikörper (Becton Dickinson) festgestellt, die Analyse erfolgte per Durchflusszytometer. Die humanen CD45+ -Zellen wurden dann auf CD19, CD3, CD4, CD8, αβ, gd, CD14 und CD56 hin geprüft.

Ergebnisse – Erfassungsrate einer Interferenz bei Depletion

Um sicherzustellen, dass residuelle αβ-T-Zellen auch nach der Depletion verlässlich und genau erkannt werden konnten, wurden unbehandelte mononukleäre Zellen inkubiert – entweder direkt mit dem markierten FITC-anti-αβ-Antikörper BMA031 oder indirekt, mit dem mit Biotin-markierten Primer BMA031, gefolgt von magnetischem MicroBeads-anti-Biotin-Antikörper. Danach wurden sie mit dem FITC (Fluoresceinisothiocyanat)-markierten BMA031-Antikörper markiert. Wie in Abbildung 1 gezeigt, hatte die Markierung der Zellen mit dem MicroBeads-Biotin-markierten Primer BMA031 und dem MicroBeads-anti-Biotin-Antikörper keine Auswirkungen auf die Bindungsqualität des FITC-markierten BMA031-Antikörpers. Es gab nur eine geringe Abnahme der Färbungs-

intensität, jedoch waren αβ-T-Zellen nach immunomagnetischer Markierung (Abbildung 1) weiterhin eindeutig gefärbt. Nachfolgende Experimente mittels weiterer Methoden zur Feststellung von residuellen T-Zellen haben diese Ergebnisse bestätigt, wie zum Beispiel durch Kombinationen aus CD3, CD4, CD8, und dem T-Zell-Rezeptor (TCR) gd. Es wurde kein Un-terschied der Empfindlichkeit des Nachweises residueller αβ-T-Zellen festgestellt (Daten nicht gezeigt), und wir haben das FITC-markierte BMA031 weiterverwendet.

Depletion von αβ-T-Lymphozyten in großem Maßstab

Bei drei Spendern wurde eine Leukapherese ohne vorherige Stammzell-Mobilisierung durchgeführt. Bei vier Spendern wurde vor der Leukapherese mit G-CSF mobilisiert. Die durch-schnittliche Zahl mononukleärer Zellen (MNC) vor αβ-T-Zelldepletion betrug 1,63 x 1010 (0,6-2,5 x 1010). Die durchschnittliche Ausbeute der MNC nach Depletion betrug 67% (56-75%). Der durch-schnittliche Anteil an T-Zellen vor Depletion be-trug 40,2% (21-67%). Der Anteil residueller Zellen nach der Depletion lag bei 0.02% αβ-T-Zellen (0,01%-0,04%). Die durchschnittliche gemesse-ne Depletion an αβ-T-Zellen betrug demnach 3,9 (3,5-3,4) Größenordnungen (Log10). Die durchschnittliche absolute αβ-T-Zellzahl nach Depletion lag bei 1,8 x 106 (0,8 x – 3,6 x 106).

Die Ergebnisse aus den mobilisierten Präpara-ten waren sehr ähnlich mit einer mittleren αβ-T-Zell-Depletion (log10) von 3,8 log-Stufen (3,5 - 4) und einer mittleren absoluten αβ-T-Zellen-Zahl von 1,36 x 106 (0,9-1,8 x 106). Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse vor und nach T-Zell-Depletion.

Nach der Depletion von αβ-T-Zellen aus den G-CSF-mobilisierten PBSC der vier Spender betrug die durchschnittliche Ausbeute von CD34-Stammzellen 66% (57%-71%) (Tabelle 1). Die die mittlere Ausbeute von CD56+-NK-Zellen und gd-T-Zellen nach Depletion aus nicht mobili-sierten und mobilisierten Spendern betrug 80% (50-100%) beziehungsweise 92% (58-100%).

Funktionelle in vivo- und in vitro-Experimente

In vitro-Experimente zur Koloniebildung und in vivo-NOD-SCID IL2rnull: Um zu beurteilen, ob diese Methode zur αβ-T-Zelldepletion einen negativen Einfluss auf die biologische Funktion der Stammzellen hat, haben wir Repopulati-onsexperimente durchgeführt. Für die Kolonie-Experimente wurden unberührte MNC, αβ-T-Zell-depletierte MNC oder vor der Depletion aus den MNC aufbereitete CD133+-Stammzellen in gleicher Anzahl in Methylzellulose plattiert. Die Kolonien konnten nach 14 Tagen ausge-wertet werden. Die Anzahl verschiedener Kolonien (BFU-E, CFU-M und CFU-GM) war bei

Abb. 2: Repräsentative Durchflussanalyse vor und nach großmaßstäblicher Depletion von αβ-T-Lymphozyten. Die Zahlen stehen für die Prozentanteile an Zellen in den Quadranten.

Tab. 1: Anzahl an CD34+- Stammzellen aus Spendern, deren Stammzellen mit G-CSF mobili-siert wurden, vor und nach der αβ-T-Zell-Depletion sowie prozentuale Ausbeute von CD34+-Zellen

Spender Anzahl an CD34+-Zellen x 107, vorher

Anzahl an CD34+-Zellen x 107, nachher

% Ausbeute an CD34+-Stammzellen

Mobilisiert 1 18 13 71



Mobilisiert 4 4,2 2,4 57

Durchschnitt 27 18 66



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den getesteten Zellpopulationen gleich (Daten nicht gezeigt). Bei den in vivo-Engraftment-Experimenten konnten wir zeigen, dass die Vorgehens-weise der αβ-Depletion keinen Einfluss auf die Engraftment-Kapazität der Stammzellen hatte.

Im Knochenmark und Thymus von Mäusen, denen der αβ-depletierte Anteil injiziert wurde, konnten wir sogar ein besseres Engraftment mensch-licher CD45+-Zellen beobachten als bei Mäusen, die mit der gleichen Menge an aufbereiteten CD133+-Stammzellen behandelt wurden. Der Anteil der erkennbaren menschlichen Zellen in Milz und peripherem Blut war bei bei-den Gruppen gleich. Da dieses neubeschriebene Mausmodell myeloisches und lymphoides Engraftment unterstützt, haben wir die menschlichen CD45+-Zellen weiter auf Lymphozyten-Subpopulationen hin analysiert. In der detaillierten Analyse wiesen die Mäuse, denen αβ-depletierte Stammzellen gegeben wurden, ein Engraftment-Niveau von CD3+-Zellen auf, das mindestens dem der Mäuse glich, die CD133-positiv-selektierte Transplantate bekommen hatten. Die Mäuse der αβ-depletierten Gruppe wiesen signifikante Konzentrationen an gd-T-Zellen auf, wie auch eine vielfach verzweigte Rekonstitution.

Fazit

Die hier dargestellte Methode ermöglicht eine neue Qualität der Trans-plantatmanipulation mit möglichen signifikanten Vorteilen. Die effektive αβ-T-Zelldepletion sollte die Verwendung von nicht HLA-passenden und NK-alloreaktiven Spenden ermöglichen. Darüber hinaus könnte sie die Anwendung von reduced-intensity conditioning (RIC)-Regimen (intensi-tätsreduzierte Konditionierung) und die Verkürzung intensiver Immunsup-pression ermöglichen und so zu vorteilhafteren Krankheitsverläufen und geringerer Mortalität bei der allogenen Transplantation führen.

Literatur

[1] Originalarbeit: S Chaleff, M Otto, RC Barfield, T Leimig, R Lyengar, J Martin, M Holiday, J Houston, T Geiger, V Huppert and R Handgretinger (2007): A large-scale method for the selective depletion of αβ T lymphocytes from PBSC for allogeneic transplantation, Cytotherapy (9,) 8: 746-754


Prof. Dr. Rupert HandgretingerEberhard-Karls-Universität TübingenUniversitätsklinik für Kinder- und JugendmedizinHoppe-Seyler-Straße 1, 72076 Tü[email protected]

Abb. 3: Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten-Anteile von BFU-E, CFU-GM und CFU-GEMM aus positiv selektierten CD133+-Stammzellen, von αβ-T-Lymphozyten befreiten PBMCs und unmanipulierten Zellen.

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Abb. 1: Prinzip und technische Umsetzung des elektrischen Stretchers. Oben: Grundlage der Zelldehnung. Das elektrische Feld zwischen zwei Elektroden polarisiert die Zelle. Die-se Ladungen werden von den Elektroden angezogen. Unten: Praktische Umsetzung auf einem Chip. Die Vergrößerung zeigt Stretcher-Elektroden im verzweigten Mikro-kanal und Manipulationselektroden zum Sortieren der Zellen.

Blitzlicht Zellsortierung

Einzelzellmessung mechanischer EigenschaftenDr. Isabella Guido, Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Peking University, Beijing, China; Dr. Magnus Jäger, Dr. Claus Duschl, Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik (IBMT), Potsdam

Markierungsfreie Methoden zur Identifikation einzelner Zellen in komplexen Gemischen werden vielerorts diskutiert. Besonders günstig ist es für zahlreiche Anwendungen, wenn die Unter-suchung zusätzlich zerstörungsfrei abläuft, die Zellen also nicht beispielsweise lysiert werden müssen, um an Inhaltsstoffe zu gelangen, sondern nachträglich noch intakt zur Verfügung stehen. Als Sortierungskriterium bietet sich die Auswertung der mechanischen Eigenschaften der Zellen an, die dank neuer Entwicklungen mit sehr geringem Aufwand schnell und auto-matisierbar vermessen werden können. Hierbei werden externe Kräfte an die einzelnen Zellen angelegt. Aus der resultierenden Verformung werden Rückschlüsse auf ihre viskoelastischen Parameter gezogen. Dieser Artikel stellt ein Zell-Stretcher-Verfahren vor, das besonders ein-fach in mikrofluidische Kanäle integriert werden kann. Wir zeigen Anwendungsfelder auf und diskutieren mögliche Probleme.

Antikörper markiert werden können, oder etwa der Nachweis charakteristischer Nukleinsäuresequenzen. Soll die Zellidentifikation diagnostischen Zwecken dienen, muss beim Nachweis berücksichtigt werden, dass im medizinischen Umfeld ein geringstmöglicher Vorbereitungsaufwand und ein rasches Messergebnis wichtig sind.

Zellmechanik als Biomarker

Vor diesem Hintergrund bieten sich Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften verschiedener Zellen als Biomarker an. Sie ermöglichen eine Zellanalyse ohne vorherige Färbeprozeduren und potentielle Artefakte durch hinzugefügte Reagenzien (labels). Die im akademischen Bereich gebräuchlichste Technik zur Bestimmung der mechanischen Parameter lebender Zellen ist die Nanoindentation mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM)1. Die Erweiterung um frequenzmodulierte Belastungen erlaubt darüber hinaus auch die Messung viskoelastischer Eigenschaften2. Ungewöhnlichere Verfahren umfassen etwa die Beobachtung einer magnetisch induzierten Verschiebung von Partikeln, die an adhärente Zellen gekoppelt wurden3. Einen wesentlichen Fortschritt der mechanischen Zellcharakterisierung stellte die Nutzung optischer Kräfte für die kontrollierte Verformung einzelner Zellen dar, aufgrund derer sich beispielsweise Zellen zweier unterschiedlich aggressiver Neoplasien unterscheiden ließen4. Dieser „optische Stretcher“ wurde in eine Durchflussmesszelle eingebaut, um seriell eine größere Anzahl von Zellen auswerten zu können. Nachfolgende Arbeiten zielten auf einen quantitativen Vergleich der OptischenStretcherTechnologie mit der etablierten AFMTechnik ab5.

Diesem Ansatz ähnelt physikalisch die Verwendung elektrischer statt optischer Kräfte, um lebende Zellen mechanisch zu verformen und daraus charakteristische Materialeigenschaften zu bestimmen. Die absolute Größe der ausgeübten Kräfte ist in beiden Fällen annähernd gleich. Der elektrische Stretcher weist jedoch eine Reihe weiterer Vorteile gegenüber den optischen Aufbauten auf: Die Notwendigkeit einer LaserQuelle entfällt, ebenso wie die der genauen Justage zweier Glasfasern. Die Integration nahezu beliebig großer und geformter Mikroelektroden in Mikrofluidiken ist aufgrund langjähriger Entwicklung in diesem Gebiet6 deutlich einfacher zu bewerkstelligen als die von Glasfasern. All dies schlägt sich nicht zuletzt im Preis eines zu konstruierenden Gerätes nieder.

Der erste Bericht eines dedizierten elektrischen Stretchers stammt aus der Zeit vor dem routinemäßigen Einsatz der Photolithographie, als Mikroelektroden noch aus Rasierklingen angefertigt wurden7. Zwar erbrachten diese Aufbauten wertvolle Daten, doch blieb ihr Einsatz meist auf grundlagenwissenschaftliche

Zellen werden in einem Gemisch verschiedener Zelltypen – wie sie in einer Patientenprobe auftreten – anhand spezifischer Biomarker

identifiziert. Als Biomarker kann zum Beispiel die Expression bestimmter Membranproteine dienen, die durch fluoreszente Liganden oder

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Fragestellungen zu den mechanischen Eigen-schaften beispielsweise von Lipidmembranen beschränkt8 – mit begrenzter medizinischer Relevanz. Erst in jüngster Zeit erfolgte die dia-gnostisch hochinteressante Nutzung der Zell-dehnung als Biomarker mit den einfachen und kostengünstigen elektrischen Aufbauten.

Der elektrische Stretcher

Das physikalische Grundprinzip des elektri-schen Stretchers ist leicht verständlich: Die einzelne zu untersuchende Zelle wird in das elektrische Feld zwischen zwei Mikroelek-troden gebracht. Infolgedessen kommt es – bei geeigneter Wahl der experimentellen Parameter – innerhalb der Zelle zur Umori-entierung von Molekülen mit Dipolcharakter oder auch zur Verschiebung der Gegenionen um fixe Ladungen herum. All diese Effekte werden zusammengefasst als die Ausbil-dung von Polarisationsladungen in der Zelle bezeichnet (Abb. 1). Im Ergebnis befinden sich effektiv elektrische Ladungen in einem äuße-ren elektrischen Feld. Gemäß den bekannten Gesetzen der Physik resultiert daraus eine wirkende Kraft. Diese zieht die Ladungen zu den Elektroden, wobei sie die Zelle ent-sprechend ihrer begrenzten Verformbarkeit dehnen. Die vorher sphärische Zelle ist daher nun ellipsoid. Die Deformation wird mit einfachen bildgebenden Verfahren als strain ε gemessen. Um schädliche Effekte auf die Zelle zu minimieren, wie etwa die räumliche

Bewegung geladener Moleküle in der Zelle oder ihrer Membran, wird üblicherweise kein zeitlich konstantes elektrisches Feld angelegt, sondern ein schnelles Wechselfeld im Kurz-wellenbereich. Dies ändert jedoch nichts am zugrundeliegenden Prozess.

Die technische Umsetzung dieses Prinzips zeigt ebenfalls die Abbildung 1: Zum Zwecke der Identifikation der Zellen über das Ausmaß ihrer elektrisch induzierten Dehnung werden zwei Mikroelektroden an geeigneter Stelle in einen Mikrokanal integriert. Dabei können sich die Elektroden je nach dem gewählten Herstellungsverfahren zum Beispiel in den Seitenwänden des Kanals befinden oder – wie hier gezeigt – auf dem Boden oder der Decke aufgebracht sein. Für die meisten untersuchten humanen Zellen erwies sich ein Abstand von 20 µm als optimal. Die elek-trische Feldstärke beträgt dann 300 kV/m. Um die identifizierten Zellen beispielsweise entsprechend ihrer Eigenschaften sortieren zu können, weisen diese Chips üblicherweise stromabwärts des elektrischen Stretchers eine Verzweigung in mehrere fluidische Ausgänge auf. Weitere Manipulationselekt-roden dienen dazu, die Zellen in einen davon zu führen. Das ganze Verfahren lässt sich im Sinne einer Geräteentwicklung weitgehend automatisieren. Dazu gehören unter anderem die Steuerung des Generators, eine rechner-gestützte Bildanalyse zur Auswertung der Zelldehnung sowie das Schalten der Ventile und der Pumpe, die den Transport der Zellsus-pension kontrollieren.

Abb. 2: Ergebnis bei verschiedenen Zelltypen. Oben: Dehnung zweier humaner neutrophiler Promyelozyten (HL-60) zwischen den Mikroelektroden. Unten: Unterschiedliche Deh-nung ε der murinen Fibroblastenlinien L-929 (lila) und 3T3 (grün). Rechts: 37°C-Isother-me (rot) in Abhängigkeit von den experimentellen Parametern elektrische Spannung U und elektrische Leitfähigkeit σ. Näheres siehe Text.

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Einige beispielhafte Ergebnisse

Ein typisches Ergebnis veranschaulicht die Abbildung 2: Die Dehnung der Zellen entlang der elektrischen Feldlinien im Spalt zwischen den Elektroden ist hier deutlich zu erkennen. Da Zellen nicht nur elastisch, sondern visko-elastisch sind, ist dieser Prozess auch zeitab-hängig. Trägt man die gemessene Dehnung ε gegen die Zeit auf, so werden Unterschiede im Verhalten verschiedener Zellen offen-sichtlich. Zum anderen liefern diese Kurven Informationen darüber, wie lange nach dem Einschalten der Spannung gewartet werden muss, bevor zwei gegebene Zelltypen sicher voneinander unterschieden werden können. Diese Zeitspanne beträgt in der Regel unge-fähr zehn Sekunden. Als Resultat erhält man Dehnungsdiagramme wie das in der Abbildung 2 gezeigte. In diesem Beispiel wurden Zellen desselben Typs (Fibroblasten) aus dem glei-chen Organismus (Maus) verglichen. Bereits bei einander derart nahe verwandten Zellen sind deutliche Unterschiede messbar. Analoge Untersuchungen erfolgten auch für humane Brustkrebszellen (MCF-7) und nichtentartete Zellen aus dem gleichen Gewebe (MCF-10)4. Bei diesen erwies sich das Mikrotubuligerüst als maßgeblich für ihr Dehnungsverhalten9. Eine weitere Anwendung des elektrischen Stret-chers fokussierte sich auf die Identifikation von Faktoren, die für die Änderung der zellulären mechanischen Eigenschaften im Verlauf der Kultivierung verantwortlich sind10.

Eine berechtigte Frage, die jede Manipula-tion lebender Zellen aufwirft, ist die nach der hervorgerufenen Schädigung. Dies betrifft natürlich auch die Stretcher. Während es für den optischen Bereich – nicht zuletzt, seitdem Laser-Pinzetten weite Verbreitung gefunden haben – umfangreiche Literatur über pho-toinduzierte Zellschädigungen gibt, sind bei elektrischen Feldern im Hochfrequenzbereich nach heutigem Wissensstand Schäden stets thermisch bedingt. Der Strom, der durch das die Zellen umgebende Medium fließt, erzeugt gemäß dem Ohmschen Gesetz Wärme. Dieser Vorgang ist klar physikalisch beschreibbar und beispielsweise mittels Infrarotthermographie quantifizierbar. Im Ergebnis erhält man für die hier vorgestellten elektrischen Stretcher die in der Abbildung 2 gezeigte 37 °C-Isotherme in Abhängigkeit von den beiden experimen-tell einstellbaren Parametern elektrische Spannung U und elektrische Leitfähigkeit σ. Wählt man einen der beiden Parameter (oder beide) hinreichend niedrig, so überschreitet die Temperatur in der Messkammer nicht die als zellunschädlich angenommenen 37 °C und andersherum. Die blauen Geraden zeigen an, dass etwa bei einer elektrischen Spannung von 6 V eine elektrische Leitfähigkeit von maximal 250 mS/m verwendet werden dürfte. Tatsäch-lich kam jedoch in sämtlichen genannten Arbeiten eine 50-fach niedrigere Leitfähigkeit

zum Einsatz. Die dazugehörige Gerade ist in der Abbildung 2 grün markiert und in dieser Darstellung von der Abszisse kaum noch zu unterscheiden. Eine nennenswerte Erwär-mung ist in diesem Bereich ausgeschlossen. Die kritische Spannung zum Erreichen von 37 °C würde dort 40 V betragen – ein etwas „pathologischer“ Wert.

Wie wird es weitergehen?

Der wichtigste Schritt auf dem Weg in die Anwendung ist die Überführung eines als wertvoll erkannten Prinzips in ein nutzbares Gerät. Entsprechende Tätigkeiten sind derzeit in Zusammenarbeit mit der ETH Lausanne im Gange. Der wesentliche Vorteil der Methodik ist dabei – neben dem einfachen Messaufbau und dem Entfallen aufwendiger Probenvor-bereitungsschritte – die geringe erforderliche Materialmenge. Dies ermöglicht besonders patientenschonende Verfahren, wie die Fein-nadelbiopsie. Eine beispielhafte Anwendung in dieser Hinsicht ist die Selektion mesenchyma-ler Stammzellen aus Gelenkproben.

Eine biologische Fragestellung für zukünf-tige Untersuchungen wird sich darauf fokus-sieren, den Zusammenhang des Biomarkers „Biomechanik“ mit den Intermediärfilamenten des Zytoskeletts weiter aufzuklären. Seit Ende der 80er Jahre ist die Korrelation zwischen der Vimentinexpression und dem Metasta-sierungsgrad von Brustkrebs bekannt11. Hier arbeiten die Stretcher um Größenordnungen schneller als jede biochemische Expressions-analyse.

Literatur

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F., Zink, M., Käs, J.A., Nat Phys 6 (2010), 730-732.


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Die wichtigsten Überlegungen bei der LaborhandschuhauswahlJaime Cassar, Roberto Greselin, KIMBERLY-CLARK PROFESSIONAL

Die Auswahl der passenden Handschuhe für Laboranwendungen gewinnt immer mehr an Bedeutung. Dazu kommen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien sowie GLP-Vorgaben (Good Laboratory Practices), deren Einhaltung nachgewiesen werden muss. Das heißt, die Auswahl von Laborhandschuhen muss nach strengen Regeln erfolgen und überzeugend begründet werden können.

nationsschutz und Funktionalität. Unter den Aspekt der Funktionalität fallen die physischen Eigenschaften von Handschuhen. Von diesen hängt die sichere und effektive Durchführung der verschiedenen Laborverfahren ab.

Handschuhe mit niedrigen Reinheitsstan-dards setzen unter Umständen Substanzen frei, die das Ergebnis eines Verfahrens ver-fälschen können. Besonders Elektrophorese und PCR (Polymerasekettenreaktion) reagie-ren hochempfindlich auf Kontamination. Handschuhe für diese Anwendungen sollten daher frei von Latexproteinen sein und keine erkennbaren Gerüche oder Rückstände auf den Oberflächen aufweisen.

Bestimmte Tätigkeiten erfordern Handschu-he mit bestimmten physischen Attributen. Dazu gehören Tastempfindlichkeit, Griffigkeit, Tragekomfort, Länge, Stärke und Reißfestigkeit. Verfahren beispielsweise, für deren effektive Durchführung ein hohes Maß an Präzision und Kontrolle notwendig ist, erfordern Handschu-he mit hoher Tastempfindlichkeit.

Anwenderspezifische Anforderungen

Menschen haben unterschiedlich große Hände. Einige haben besonders empfindliche Haut oder reagieren allergisch auf bestimmte Substanzen.

Handschuhe müssen gut sitzen, damit sie die gesundheits-, sicherheits- und anwen-dungsspezifischen Anforderungen erfüllen, für die sie ausgewählt wurden. Ein zu großer Handschuh beeinträchtigt die Tastempfind-lichkeit oder sitzt zu locker, so dass er den erforderlichen Schutz nicht bieten kann.

Handschuhe aus Naturkautschuklatex können bei manchen Menschen allergische Reaktionen unterschiedlichen Schweregrades auslösen, von Typ I (anaphylaktischer Schock) bis Type IV (Kontaktdermatitis). Durch latex-freie Handschuhe oder Latexhandschuhe mit einem geringen Anteil allergieauslösender Proteine lässt sich das Risiko von Latexaller-gien mindern.

Chemische Beschleuniger oder Prozessche-mikalien, die bei der Handschuhfertigung zum Einsatz kommen, können Hautreizungen aus-lösen, besonders bei Personen mit empfindli-cher Haut. Unterschiedliche Hersteller nutzen unterschiedliche chemische Beschleuniger und Prozesschemikalien und setzen unter-schiedlich aufwendige Reinigungsprozesse ein. Durch Handschuhe, deren Gehalt an che-mischen Beschleunigern und Prozesschemika-lien dank wirkungsvoller Reinigungsprozesse unterhalb der Messgrenze liegt, lässt sich die Gefahr von Hautreizungen verringern.

Kontakt

Jaime Cassar [email protected]

Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien: Laborhandschuhe müssen gemäß der EU-Richtlinie 89/686/EWG als PSA-Produkt der Kategorie 3 – für den Einsatz in Bereichen, in denen potentiell irreversible Folgen oder Lebensgefahr drohen – zertifiziert sein. Die Verpackung muss das CE-Zeichen tragen, gefolgt von vier Ziffern als Kennzeichnung des Instituts, das die Handschuhe als PSA-Produkt der Kategorie 3 zertifiziert hat. Darüber hinaus muss die Konformität mit folgenden Standards durch Piktogramme auf der Verpackung angegeben sein: Schutz vor Chemikalien gemäß EN374-1 (geringes Risiko), Schutz vor Mikroorganismen gemäß EN374-2, allgemeine Anforderungen an Schutzhand-schuhe gemäß EN420.

Handschuhe mit einer Zer tif izierung als Medizinprodukte gemäß der Richtlinie 93/42/EWG sind für den Einsatz im Labor nicht geeignet, es sei denn, sie sind auf der Verpackung zusätzlich als PSA-Produkt der Kategorie 3 gekennzeichnet. Das Labor muss unter Beachtung der Teststandards für die betreffenden Risiken, die Gefährdungsart und den Gefährdungsgrad der Mitarbeiter ermitteln und Handschuhe mit entspre-chender Zertifizierung und Leistungsstufe auswählen.

Gefahr durch Chemikalienspritzer

Chemikalienspritzer können einen Hand-schuh durchdringen und den Träger schä-digen. Bei der Risikobewertung müssen die Gefahrenstoffklasse der Chemikalie sowie deren potentielle Einwirkdauer im Rahmen der fraglichen Anwendung berücksichtigt werden. Empfehlenswert sind Handschuhe, deren Durchdringungszeit laut veröffentlich-ten EN374-3:2003-Testdaten – bezogen auf die

betreffende Chemikalie in der fraglichen Kon-zentration – länger ist als die Einwirkdauer.

Gefahr durch Mikroorganismen

Mikroorganismen können durch mikrosko-pisch kleine Löcher in Handschuhe eindringen und den Träger schädigen. Laut Teststandard EN374-2:2003 für den Schutz vor Mikroor-ganismen müssen die Handschuhhersteller mithilfe von Luft- oder Wasserdichtigkeits-tests den AQL-Wert (Acceptable Quality Level) ermitteln und damit die Lochfreiheit der Handschuhe bestätigen. Ein niedrigerer AQL-Wert entspricht laut ISO 2859 einer ge-ringeren Defekttoleranz bei der betreffenden Fertigungscharge. Für die Arbeit mit Viren sollten Handschuhe gemäß EN374-2 Stufe 3 zertifiziert sein, was einem AQL-Wert von 0,65 entspricht. Handschuhe mit einer Zertifizie-rung gemäß EN374-2 Stufe 2 dagegen haben einen AQL-Wert von 1,5 und eignen sich eher zum Schutz gegen Bakterien oder Pilze.

Anwendungsspezifische Anforderungen

Je nach Anwendung bestehen unterschied-liche Anforderungen hinsichtlich Kontami-www.laborwelt.de

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Wissenschaft Toxizitätsscreening

Neues zelluläres QT-Screen-Konzept mit adulten HerzmuskelzellenDr. Lars Kaestner, Prof. Dr. Peter Lipp, Forschungsstelle für Molekulares Imaging und Screening, Institut für Molekulare Zellbiologie, Medizinische Fakultät, Universität des Saarlandes, Homburg

Neue Medikamente müssen vor ihrer Markteinführung auf Herztoxizität geprüft werden. Bisher fehlen hierzu Verfahren, die aussagekräftig und im Industriemaßstab durchführbar sind. In einer Reihe von Arbeiten wurden kürzlich Ansätze und Voraussetzungen publiziert, die sich mit der zuverlässigen Gewinnung und Kultivierung adulter Herzmuskelzellen, optischen molekularen Sensoren und mikroskopischen Konzepten beschäftigen. Die Weiterführung dieser Arbeiten unter Beteiligung eines Konsortiums industrieller Partner wird vom Bundes-ministerium für Bildung und Forschung im Verbundprojekt „CordiLux“ gefördert.

dabei der Effekt von Substanzen auf nur einen einzelnen molekularen Baustein getestet. Da aber sehr viele Elemente und Prozesse die Zelle potentiell proarrhythmogen beein-flussen können, ist ein aussagekräftigeres Verfahren zu bevorzugen, das den Test aller beteiligten Strukturen und Funktionseinheiten einschließt.

Adulte Herzmuskelzellen in Kultur

Isolierte Herzmuskelzellen sind ein populäres Zellmodell in der pharmakologischen und kardialen Grundlagenforschung. Dabei sind neonatale Zellen bezüglich der Isolation und Handhabung wesentlich einfacher und robuster, aber leider auch bezüglich ihrer zellulären Charakteristika völlig verschie-den von adulten Zellen2. Fortschritte in der reproduzierbaren Zusammensetzung von Verdauungsenzymen zur Zellvereinzelung haben in den letzten Jahren zu verlässlichen Protokollen für die Isolation adulter Kardio-myozyten geführt3. Außerdem wurden die Kulturbedingungen soweit optimiert, dass die Zellen mindestens drei Tage ohne gra-vierende morphologische oder funktionelle Änderungen untersucht werden können4,5. Damit sind wesentliche Voraussetzungen geschaffen, in isolierten Herzmuskelzellen in vitro genetische Manipulationen vorzuneh-men. Dies betrifft auch genetisch kodierte Biosensoren – insbesondere Membranpoten-tialsensoren (siehe unten).

In Herzmuskelzellen differenzierte Stamm-zellen besitzen ein großes Potential für den Einsatz in Screening-Anwendungen, weil dies die Bereitstellung der Zellen vereinfachen würde. Leider lassen sich Stammzellen zur Zeit noch nicht zuverlässig und determiniert in entsprechender Anzahl in Vorhof-, Ventri-kel- oder Schrittmacherzellen differenzieren und besitzen daher gegenüber isolierten adulten Ventrikelzellen noch schwerwie-gende Nachteile. Diese Situation wird sich allerdings wahrscheinlich in den nächsten Jahren ändern; Stammzellen sollten somit zunehmend an Bedeutung gewinnen.

Molekulare Sensoren

Molekulare Sensoren zum optischen Aus-lesen von Membranpotentialen sind seit mehr als 40 Jahren bekannt6 und wurden seitdem ständig weiterentwickelt. Dennoch konnte erst kürzlich ein Ansatz veröffentlicht werden, der den Einsatz von Membranpo-tentialsensoren zur quantitativen Messung des Aktionspotentials ermöglicht, ohne das Aktionspotential selbst zu beeinflussen2. Die-

Die Induktion arrhythmogener Potentiale ist eine der häufigsten akuten und lebensbedro-henden Nebenwirkungen pharmakologisch wirksamer Substanzen. Das prominenteste Beispiel eines Medikamentes das aus diesem Grund vom Markt genommen werden musste, ist das Arthrose- und Rheumamedikament Vioxx®.

QT-Screens – state of the art

Inzwischen ist es etablierter Wissensstand, dass eine Verlängerung des QT-Intervalls im

EKG mit einer proarrhytmogenen Aktivität assoziiert ist. Ebenfalls etabliert ist die Erkennt-nis, dass das zelluläre Äquivalent des QT-Inter-valls die Länge des Aktionspotentials darstellt1. Das Aktionspotential wiederum setzt sich aus vielen Komponenten zusammen, die sich molekularen Entitäten zuordnen lassen. An der Verlängerung des Aktionspotentials ist häufig ein Kaliumkanal beteiligt, der hERG-Kanal. Daher hat man diesen heterolog in Zelllinien exprimiert und führt an diesen Zellen mit Patch-clamp-Robotern automatisierte Screens durch. Die einfache Handhabbarkeit der Zellen ist ein Vorteil dieser Methodik. Allerdings wird

Abb. 1: Dreidimensionale Teilrekonstruktion einer adulten Herzmuskelzelle aus der Haupt-kammer des Herzens, die mit Hilfe eines Membranpotentialsensors gefärbt wurde. Zu erkennen ist die komplexe, netzartige Struktur der Membraneinstülpungen. Das Übersichtsbild zeigt die gesamte Länge der Zelle (Länge der Pfeile entspricht 12 µm), in der herausvergrößerten Detailabbildung entspricht die Länge der Pfeile 2 µm.

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Wissenschaft Toxizitätsscreening

se Sensoren sind kleine Fluoresenzmoleküle, mit denen die Herzmuskelzellen angefärbt werden. Ein Beispiel für eine solche Färbung ist in Abbildung 1 zu sehen. Parallel dazu gibt es seit fast 15 Jahren Bestrebungen, genetisch kodierte Potentialsensoren zu etablieren (für einen Review siehe [7]). Einer der am weitesten entwickelten genetisch kodierten Potentialsensoren ist ein Konstrukt namens Mermaid8, das in Herzmuskelzellen umfas-send charakterisiert wurde2,9,10. Ob sich in Zukunft in pharmakologischen Screens eher niedermolekulare Farbstoffe oder genetisch kodierte Sensoren durchsetzen werden, ist noch offen. Aktuell tendiert die Entwicklung bei beiden Ansätzen zu Farbstoffen, die in den roten Spektralbereich verschoben sind11, weil das einerseits für die Zellen weniger phototoxisch ist und andererseits auch Autofluoreszenzen reduziert.

Optische Technologien

Optische Messungen von Aktionspotentialen sind bisher entweder photometrisch durch-geführt worden (die gesamte Fluoreszenz der Zelle wird auf einen Punkt fokussiert) oder örtlich stark eingeschränkt in Form von Linien- oder Einzelpunktmessungen. Die Sen-sitivität einer neuen Generation von Kameras mit sogenannten „scientific CMOS“-Chips12 wird es künftig ermöglichen, aussagekräftige Bilder mit einer Aufnahmegeschwindigkeit von 1.000 Bildern pro Sekunde zu erhalten. Diese Technologie erlaubt es, ein Kollektiv von 10 bis 15 Herzmuskelzellen gleichzeitig zu messen. Ein Screening-Verfahren stellt aber auch an das Mikroskop spezielle An-forderungen, beispielsweise die zeitgleiche Messung von mindestens zwei spektralen Kanälen oder die Möglichkeit zur Einbindung

in automatisierte Prozesse. Abbildung 2 zeigt das Design eines Mikroskop-Prototypen, der inzwischen Produktreife erreicht hat und für Screening-Anwendungen geeignet ist. Da die Detektion der Fluoreszenz effektiv erfolgen soll, empfehlen sich Ölimmersionsobjektive mit einer hohen numerischen Apertur. Das scheint zunächst im Widerspruch zu den Anforderungen an Screens mit Mikrotiter-platten zu stehen. Allerdings wurde kürzlich ein Konzept vorgestellt, das die Verwendung von speziellen Multiwellplatten unter Ver-wendung von Ölimmersionsobjektiven in Screeningprozessen erlaubt13. Zusätzlich kann man in diesen Platten – durch in den Deckel eingebrachte Kohlenstoffelektroden – eine elektrische Feldstimulation der Herzmuskel-zellen erreichen. Eine solche Multiwellplatte ist in Abbildung 3 zu sehen.

CordiLux – die Perspektive

Für die Durchführung optischer, zellbasierter QT-Screens sind, wie oben ausgeführt, die grundlegenden Voraussetzungen geschaffen worden. Durch die berührungslose Messung an adulten Herzmuskelzellen ist das Potential für pharmakologisch-prädiktive Aussagen sehr hoch14. Aus diesem Grund fördert das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) seit dem 1. Juli 2011 ein Verbundprojekt der Pharmafirmen (Pharmacelsus GmbH, Saarbrücken und PHAST GmbH, Homburg) mit Geräteherstellern (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing und CyBio AG, Jena), einer Soft-warefirma (arivis GmbH, Rostock) und zwei Un-ternehmen der Biodiagnostik bzw. Nanotech-nologie (ibidi GmbH, Martinsried und CoTec GmbH, Karlstein) in Zusammenarbeit mit der Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes. Dieses Projekt mit dem Acronym

Abb. 3: 24-Well Platte mit integrierten Koh-lenstoffelektroden im Deckel zur elektrischen Feldstimulation von Herzmuskelzellen. Diese Abbildung ist ein Nachdruck aus der Originalpu-blikation [13].

„CordiLux“ liegt im BMBF-Forschungsschwer-punkt Biophotonik15. Innerhalb von drei Jahren sollen die notwendigen Technologien zu einem gesamtheitlichen Design zusammengeführt werden.

Literatur

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[11] Lee, P., Bollensdorff, C., Quinn, T.A., Wuskell,J.P., Loew, L.M., Kohl, P. Single-Sensor System for Spatially-Resol-ved, Continuous and Multi-Parametric Optical Mapping of Cardiac Tissue. Heart Rhythm 8 (2011), 1482–1491.

[12] Coates, C., Fowler, B., Holst, G. Scientific CMOS tech-nology – A high-performance imaging breakthrough. White Paper (2009) 1–14.

[13] Müller, O., Tian, Q., Zantl, R., Kahl, V., Lipp, P., Kaestner, L. A system for optical high resolution screening of elec-trical excitable cells. Cell calcium 47 (2010), 224–233 .

[14] Kaestner, L., Lipp, P. Screening action potentials: the power of light. Front Pharmacol 2 (2011), 42 .

[15] Biophotonik at <http://www.biophotonik.org>


Dr. Lars KaestnerProf. Dr. Peter LippUniversität des SaarlandesMedizinische FakultätForschungsstelle für Molekulares Imaging und Screening – Gebäude 6166421 Homburg/SaarTel.: +49-(0)-6841-1626103Fax: +49-(0)[email protected]

Abb. 2: Prototyp-Design eines Mikroskops, welches repräsentativ für eine neue Generation vom Mikroskopen ist, die präzise Screens mit Mikrotiter-platten erlauben und Emissionsde-tektion in zwei spektralen Kanälen ermöglichen. Diese Abbildung ist ein Nachdruck aus der Originalpub-likation [14].

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Expertenpanel: Next-Generation-Sequencing Mit der Markteinführung kompakter Desktop-Sequencer mit vergleichsweise niedrigerem Durch-satz ist das Next-Generation Sequencing für jedes Labor erschwinglich geworden. Mitte September hatten sich die Preise für ein Endgerät auf 40.000 bis 60.000 Euro halbiert. Damit werden nicht länger nur die wenigen hundert großen Zentren für Genomsequenzierung bedient, sondern die schnelle Sequenzierung dringt in den Forschungsmarkt und das Gesundheitswesen vor. Experten prognostizieren, das NGS die PGFE bereits in ein bis zwei Jahren in der mikrobiellen Diagnostik ersetzt haben wird. Was die Systeme leisten, was Dienstleister anbieten und wo Zukunftsanwendungen liegen, beleuchtet LABORWELT in der neuen Rubrik Expertenpanel. Hier kommen Spezialisten aus Industrie und Academia zu Wort.

LABORWELT:Wie können Benchtop-Next-Generation-Sequenzer zu einer genombasierten Diagnose und Überwachung von Epidemien beitragen?

Harmsen:Die Karten auf dem Markt für Next-Gene-ration-Sequenzer (NGS) werden gerade neu gemischt. War NGS seit den Anfängen im Jahr 2005 eine Angelegenheit von weltweit wenigen hundert Genom-Sequenzierzentren, so öffnet sich gerade durch Einführung von erschwinglichen Benchtop-NGS-Geräten ein riesiger neuer Markt. Jedes Krankenhauslabor wird zum potentiellen Kunden – es tritt quasi gerade eine „Demokratisierung“ von NGS ein. Benchtop-NGS-Geräte, wie die Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) oder in Kür-

Prof. Dr. Dag Harmsen Dag Harmsen leitet die Forschungsab-teilung an der Poliklinik für Parodon-tologie der Universität Münster. Seine Arbeitsgruppe erlangte weltweite Aner-kennung durch Arbeiten zur angewand-ten Bioinformatik in der Mikrobiologie und baute weltweit die größte öffentlich molekulare Typisierungsdatenbank auf. Kontakt: [email protected]

ze der Illumina MiSeq, sind jedoch nicht nur günstig in der Anschaffung, sondern skalierbar im Einsatz und insbesondere sehr schnell, das heißt von der DNA zur Sequenz in ein bis zwei Tagen. Damit eignen sie sich hervorragend für den Routineeinsatz in der Mikrobiologie, Onkologie, Humangenetik oder Transfusions-medizin. Gerade beim Einsatz im Rahmen von mikrobiellen Ausbruchsgeschehen ist Geschwindigkeit natürlich Trumpf. Der Einsatz von NGS steht damit gerade am Wendepunkt von der Grundlagen- hin zur angewandten Forschung und Routinediagnostik. Dies konnte wir an der Universität Münster (WWU) gerade beim Management von EHEC in Deutschland und Klebsiella OXA-48 in den Niederlanden exemplarisch für die Bakteriologie demonst-rieren. Dies dürfte den Beginn der prospektiven genomischen Epidemiologie markieren. Hierbei werden klassische epidemiologische Überwa-chungsparameter (Ort, Zeit und Person) mit genomweiten NGS-Typisierungsergebnissen für spezifischere Frühwarnsysteme kombiniert. In letzter Konsequenz könnten beispielsweise auch Abwässer mit NGS für eine „Krankheiten-Wetterkarte“ überwacht werden, um durch die Kenntnis von der Verbreitung von Erregern in der Umwelt noch vor dem Auftreten von Aus-brüchen geeignete Präventionsmaßnahmen ergreifen zu können.

Die größten Herausforderungen beim Routineeinsatz von NGS dürften zukünftig in der bioinformatischen Analyse und in der Beseitigung von legalistischen (Datenschutz) und sozialen (einheitliche Datenbankformate)

Roche brachte 2010 mit dem GS Junior das erste Benchtop-NGS-Gerät auf den Markt.

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LABORWELT

Dr. Tom Jarvie

Thomas Jarvie ist als internationaler Pro-duktmanager bei 454 Life Sciences an der Entwicklung der 454 Hardware, Reagenzien, Kits und Software beteiligt. Im Anschluss an seine Postdoc-Zeit arbeitete der Biophysiker von 1995 bis 2002 für Curagen, bevor er in der High-troughput Sequencing Facility und ab 2005 als Technical Product Manager in der Applikationsentwicklung für das 454-Sequen-cing tätig war. Kontakt: [email protected], www.my454.com

LABORWELT:Kürzlich berichtete Roche über eine weitere Verlängerung der Leseweiten ihrer Next-Ge-neration-Sequenziersysteme. Welche Vorteile ergeben sich dadurch gegenüber anderen Se-quenzern am Markt?

LABORWELT:Welche Vorteile bietet die Nutzung von NGS-Dienstleistungen auf mehreren Technologie-plattformen gegenüber einem eigenen Gerät?

De Leeuw:Sämtliche Next-Generation-Sequencing-Tech-nologien haben ihre Stärken und Schwächen. Keine der aktuellen Plattformen ist imstande, komplette Coverage auch nur für ein moderat komplexes mikrobielles Genom zu liefern – ty-pischerweise werden kurze Stränge mit hohem GC-Anteil nicht abgedeckt. Dazu kommt, dass es für das Programme schwierig ist, Teile des Genoms richtig zu asssemblieren, zum Beispiel die multiplen Kopien der ribosomalen Operons in mikrobiellen Genomen. Bei den Genomen höherer Organismen, wie etwa Säugern oder Pflanzen, brechen Regionen “niedriger Komple-xität” die Assemblierung in viele Contigs auf.

Die kombinierte Nutzung multipler Plattfor-men kann die Qualität der Resultate wesent-lich verbessern. Ein Beispiel ist die “hybride” Assemblierung unter kombinierter Nutzung der Roche/454- und Illumina-Plattform – also entweder durch den Einsatz beider Auslesear-ten nacheinander oder durch stufenweise

Dr. Marcel de Leeuw

Marcel de Leeuw ist Staff Bioinformatics Scientist bei Beckman Coulter Genomics in Grenoble. Der Dr. der Informatik ar-beitet seit 12 Jahren in der Genomfor-schung. Nach Tätigkeiten als Head of IT bei Genome Express und als Global Busi-ness Leader bei Cogenics wechselte er zu Beckmann Coulter Genomics in Grenoble. Kontakt: [email protected]

Hindernissen liegen. Wir und andere träumen etwa von einer „Bioinformatik für Dummies“, welche automatisch aus den NGS-Rohdaten umgangssprachliche Berichte für behandelnde Ärzte oder Mitarbeiter der Gesundheitsdienste erzeugt.

Bearbeitung. Die Roche/454-Reads liefern mittlere und lange Leseweiten und nutzen normalerweise eine 3 kb mate-pair-Bibliothek. Die Illumina-Reads bieten eine hohe lokale Sequenzqualität und in schlecht abgedeckten Sequenzbereichen, in denen beide Technolo-gien Schwierigkeiten haben, eine ergänzende Sequenzabdeckung. Da es in der Regel nicht rentabel ist, mehrere Next-Gen-Plattformen für den Eigenbedarf zu implementieren, bietet es sich an, die Vorteile der Kombination von mehreren Next-Gen-Plattformen bei einem Dienstleister zu nutzen.

Beckman Coulter Genomics setzt diesen hybriden Ansatz seit über einem Jahr routine-mäßig ein, der so de facto zum Gold-Standard für die publikationsfertige Sequenzierung geworden ist. Dieser kombinierte Ansatz reduziert die Notwendigkeit des Finishings ge-nomischer Regionen niedriger Qualität mit der Sanger-Methode. Kombiniert mit der automa-tischen Präparation der Sequenzbibliothek vor der Sequenzierung und der bioinformatischen Auswertung danach, ermöglicht dieses Vorge-hen eine sehr kosteneffiziente und schnelle genomische Sequenzierung.

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Wissenschaft Expertenpanel

Jarvie:Der Vorteil der langen Leseweite der 454-Sys-teme GS FLX+ und GS Junior ist ihre Fähigkeit; komplexe biologische Vorgänge aufzuklären. Anders als kurze Reads (von 50 bis 100 Nuk-leotiden) helfen lange Leseweiten (von 500 bis 750 Basen), weit voneinander entfernte Genvariationen funktionell miteinander zu verknüpfen und Sequenzen zu unterscheiden, die über weite Distanzen identische Sequenzen aufweisen. Das ist bei einer Reihe von Anwen-dungen wichtig. Beim Transkriptom-Sequen-cing decken lange Leseweiten mehrere Exons ab und geben eindeutig Auskunft darüber, dass diese zum selben Transkript gehören. Bei der de novo-Sequenzierung von Organismen erhält man so einen besseren Überblick über die Vollängengene beziehungsweise Transkrip-te. In Organismen, die ein einzelnes Gen in multiplen Isoformen exprimieren, sind lange Reads entscheidend, um die Expression der verschiedenen Isoformen aufzuklären. Denn um die zahlreichen Exonunterbrechungen zu überspannen, muss die Leseweite lang genug sein.

In jüngeren Mikrobiomstudien wurden kom-plexe mikrobielle Gemeinschaften anhand der Sequenzierung ihrer 16S-rRNA in verschiedenen ökologischen Nischen untersucht. Hier ist das 454-Sequencing bereits zum de facto-Standard geworden und ermöglicht die Klassifizierung der Mikroorganismengemeinschaften bis auf Gattungs- oder Artebene. Next-Generation-Sequenzer, die kurze Leseweiten liefern, sind bei der Klassifikation deutlich gröber und klassifizieren nur bis zur Stammesebene.

Eine korrekte Assemblierung der Sequenz großer komplexer Genome, zum Beispiel von Pflanzen oder Tieren, ist aufgrund der darin enthaltenen zahlreichen Repeats nur mit langen Leseweiten möglich, die die Re-peats überspannen. Auch die in komplexen Genomen auftretenden Pseudogene und Familien nahe verwandter Gene können mit den langen und sehr genauen Reads unter-schieden werden. Zusammengefasst sind das GS FLX+ und das GS Junior System sehr leistungsfähige Werkzeuge für die de novo-

Dr. Bernd Timmermann

Dr. Bernd Timmermann leitet seit Ende 2007 die Next-Generation Sequencing-Gruppe, seit 2010 die Max-Planck Core Sequencing Facility am Berliner MPI für molekulare Ge-netik (MPIMG). Nach Promotion in Moleku-larbiologie an der Charité leitete er die DNA-Sequenzierung der Genprofile AG. Seit 2002 ist er leitender Wissenschaftler am MPIMG. Kontakt: [email protected]

LABORWELT:Worin liegen für die Nutzer von Desktop-NGS derzeit die Hauptpro bleme und Kostenfallen?

Timmermann:Um auch kleinere Labore adressieren zu können, brachte Roche im März 2010 den GS Junior auf den Markt. Dieser produziert ca. 100.000 Reads mit einer Leselänge von ca. 400 Basen und zeichnet sich durch seine Schnelligkeit und Stabilität aus. Der Ion PGM Sequencer von Ion Torrent, der die gleiche Zielgruppe hat, kämpft derzeit mit noch sehr unzureichenden Leselän-gen (momentan ca. 160 Basen) und vor allem mit der noch ungenügenden Genauigkeit des Basecallings. Der Dritte im Bunde wird der MiSeq von Illumina sein. Gegenwärtig werden hier die ersten Geräte in Europa ausgeliefert. Er basiert auf der etablierten Illumina-Technologie und soll mittels paired end-Sequenzierung (2 x 150 Basen) einen Duchsatz von 1 GB erreichen.

Während noch vor kurzem die NGS-Daten-auswertung als Hauptproblem galt, zeigt sich nun, dass eher die Probenvorbereitung oft unterschätzt wird. Zur Hauptnutzergruppe des GS Junior gehören bereits heute die diagnosti-schen Labore. Hier dürfte eine der wichtigsten Applikationen die Amplicon-Sequenzierung, z.B. zur Analyse ausgewählter Kandidatengene sein. Aber bereits bei den 100.000 Reads des Gerätes stellt sich die Frage der Äquimolarität der ein-gesetzten Produkte – alle PCR-Produkte müssen mit der gleichen Anzahl eingesetzt werden, um am Ende auch eine gleichmäßige Verteilung der resultierenden Reads zu gewährleisten. Diese Fragestellung ist sicher lösbar, erfordert jedoch einen gewissen Automatisierungsgrad, also auch zusätzliche Investitionen. So scheint z.B. das Fluidigm Access Array System eine sehr gute Lösung in Kombination mit dem GS Junior.Generell ist allen potentiellen Nutzern von NGS Desktop-Geräten zu empfehlen, sich den gesamten Weg der Datenproduktion von PCR/ Library-Präparation, den jeweiligen monoklo-nalen Amplifikationsschritt, die Sequenzierung über die Datenauswertung – mit Blick auf die Praktikabilität im individuellen Laborsetting genau anzuschauen.

Sequenzierung und die Assemblierung jeder Genomgröße.

Ein letztes Beispiel ist die gezielte Sequen-zierung hochvariabler Regionen, wie etwa in Virusgenomen oder den HLA-Genen. In Viren, wie etwa HIV, ist das Genom ist in bestimm-ten Loci so variabel, dass lange Leseweiten erforderlich sind, um die hochvariablen Teile zu überbrücken und die stabileren Teile zu verbinden. Auch die HLA-Region ist so hoch-variabel, dass es erforderlich ist, die multiplen Variationen mittels einer langen Leseweite eindeutig miteinander zu verbinden und so den individuellen HLA-Typ zu bestimmen. Das GS Junior System ist ein ideales Werkzeug, um gezielt interessierende genomische Bereiche über Target-Anreicherungstechnologien oder Multiplex-Amplicons zu sequenzieren. Kimtech Performance Curves

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Branche Labormarkt im Umbruch

Milliardenschwere Übernahmen sind gang und gäbe im Labormarkt. Grund genug, in dieser LABORWELT-Serie einen Blick auf die Player, ihre Strategien und Deals zu werfen. Klar ist: Elefantenhochzeiten bleiben an der Tagesordnung. Die Preise bleiben hoch, genauso wie die Wahrscheinlichkeit, dass sich der Labormarkt in zehn Jahren völlig anders darstellen wird als heute. Die Tecan AG hat sich in den vergangenen Jahren neu ausgerichtet und sich auch als Komponenten-Zulieferer etabliert. Nach einem Höhenflug an der Börse bremsen jetzt jedoch Projektverzögerungen die hochfliegenden Erwartungen. Zudem muss ein neuer Chef gesucht werden.

Tecan: Hausaufgaben für den neuen ChefDr. Patrick Dieckhoff, BIOCOM AG

Mehr als verdreifacht hatte sich die Aktie des Schweizer Laborausrüsters Tecan AG vom Tief im Jahr 2009. Seitdem schien das Unterneh-men mit Sitz in Männedorf bei Zürich sich in einem unaufhaltbaren Höhenflug zu befinden. Der Börsenwert überschritt erstmals seit lan-gem wieder lässig die 500 Mio. Euro-Grenze. Im Sommer verließ den Spezialisten für Labor-automation jedoch der Erfolg, und zwar ohne dass er etwas dafür gekonnt hätte.

OEM-Projekt verschiebt sich

Denn Tecan produziert nicht nur eigene Gerä-te, sondern tritt auch als OEM-Partner auf. Als sogenannter Originial Equipment Manufactu-rer liefert das Unternehmen Komponenten für Geräte Dritter zu. Die werden jedoch nur gebraucht, wenn der Kunde den entspre-

chenden Erfolg mit seinem Gerät hat. Im Falle des großangekündigten „P14“-Projektes, das nach Analystenschätzung im kommenden Jahr für 12 Mio. Schweizer Franken Umsatz sorgen sollte, wurde Tecan eine verzögerte Produkteinführung zum Verhängnis.

Tecan-Chef vor Abschied

Die anvisierten Verkäufe für das kommen-de Jahr schrieben die Analysten ab. Solche Überraschungen schätzt die Börse gar nicht. Parallel dazu musste Tecan vermelden, dass sich ein Wechsel in der obersten Führung anbahnt. Nach rund sechs Jahren im Amt soll der Vorstandsvorsitzende Thomas Bachmann ersetzt werden. In seiner Amtszeit hatte sich der Kurs des Unternehmens mehr als verdop-pelt, genauso wie der Umsatz, der auf 370 Mio.

CHF im vergangenen Jahr stieg. Gründe für das Ausscheiden des 52-jährigen CEOs wurden nicht genannt. Sein Vertrag, der turnusgemäß am 31. Oktober dieses Jahres endet, wird nicht verlängert. Bei Anlegern weckt das unschöne Erinnerungen, denn vor Bachmanns Ernen-nung im Jahr 2005 gehörte eine regelmäßige Chefdebatte quasi zum Tagesgeschäft in Männedorf. Zudem verzettelte sich die Firma Anfang des Jahrtausends mit zahlreichen Übernahmen. Auch Bachmann hatte sich mit dem Kauf des Probenlagerungsspezialisten REMP verspekuliert. Im vergangenen Jahr wurde das Unternehmen mit zweistelligem Millionenverlust verkauft. Unter Analysten gilt Bachmann jedoch als derjenige, der das Unternehmen auf Kurs und zwei Kernbereiche ausgerichtet hat. Immer wieder wurde Tecan selbst als Akquisitionsziel gehandelt.

Laborzulieferer mit eigenen Produkten

Im OEM-Bereich liefert Tecan Komponenten zu, die von Partnern im Bereich Labor, Dia-gnostik oder Forensik verkauft werden. Die Schweizer treten aber auch als Verkäufer eigener Systeme auf. Bekannt sind vor allem die automatisierten Liquid-Handling-Systeme aus der Freedom-EVO-Serie. Aber auch Mik-roplatten-Auslese- und Waschgeräte sowie Microarray-Scanner gehören zum Programm des Life Sciences-Spezialisten.

Geographische Expansion und neue Geräte im Fokus

Will Tecan als eigenständiges Unternehmen am Markt erfolgreich bleiben, hat der Nachfol-ger von Thomas Bachmann einige Hausaufga-ben zu erledigen. Denn derzeit erwirtschaftet Tecan kaum mehr als 10% des Umsatzes in Asien. Die Verkäufe in anderen Regionen wie etwa Südamerika oder dem Nahen Osten wer-den gar nicht erst einzeln aufgeschlüsselt. Bei deren Eroberung sollen auch neue Produkte wie etwa eine neue Liquid Handling-Plattform helfen, die derzeit als größtes Projekt in der Tecan-Geschichte entwickelt wird.

Zu Tecans bekanntesten Produkten gehören Liquid-Handling-Plattformen.

Tecan in Zahlen:

Umsatz: 370 Mio. CHF (2010)Gewinn (EBIT): 56 Mio. US-$ (2010)Umsatzrendite: 15,1% F&E-Investiton: 2,5% des Umsatze

Börsenwert: 536 Mio. Euro (Stichtag 19.10.)Mitarbeiter: 1.100 CEO: Thomas Bachmann (bis 31.10.)

Umsätze:

– OEM 44%– Verkauf an Endbenutzer 66%

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Blitzlicht Regenerative Medizin

Standardisierung der Stammzell-Gewinnung und -HerstellungDr. Andreas Emmendörffer, V-Care Biomedical GmbH, Leipzig

Die standardisierte Gewinnung und Herstellung von Stammzellen umfasst alle Teilschritte von der Entnahme bis zur Auslieferung der Zellen. Auf der Basis des Produktdesigns und einer Risikoanalyse werden die einzelnen Schritte geplant, umgesetzt und dokumentiert. Auf die gestiegenen regula-torischen Anforderungen haben sich Kliniker, Hersteller und Lieferanten eingestellt. Die Detailtiefe der Qualitätsnachweise für produktberührende Teile oder Medien ist in den letzten Jahren deutlich höher geworden. Die Produkte müssen hinsichtlich Wirksamkeit, Sicherheit, Reinheit, Immunogenität, Tumorigenität und Biodistribution charakterisiert werden. Eine enge Zusammenarbeit zwischen Herstellern, Behörden, Lieferanten und Anwendern und das Verständnis für die ggf. unterschiedlichen Anforderungen schaffen die besten Voraussetzungen für ein sicheres und wirksames Produkt.

standardisierte Zellen, die mit einem entspre-chenden Zertifikat ausgestattet sind, essentiell und eine Voraussetzung für reproduzierbare und international vergleichbare Studien sind. Die Zeiten, in denen Daten in hochrangigen Zeitschriften mit unkontrollierten Zellen oder Zelllinien publiziert werden, sollten der Vergan-genheit angehören. Entsprechende Daten für die Reinheit der Zellen – zumindest der Nach-weis der Mycoplasmen-Freiheit – sollten für den Material- und Methodenteil Pflicht werden. Mit dem berechtigten öffentlichen Interesse, dass Erkenntnisse der Grundlagenforschung in die Anwendung gelangen sollten und auf die Weise Fördergelder auch zu marktfähigen Produkten führen, erscheinen Maßnahmen zur Standardisierung der (Stamm-)Zellgewinnung geboten.

Während diese Anforderungen in der Häma-tologie und Onkologie schon seit den 80er Jah-ren des letzten Jahrhunderts für die hämatopo-etischen Stammzellen entwickelt und verfeinert wurden, ist dies für die anderen Stammzellarten (mesenchymale oder neuronale, adulte organ-spezifische Stammzellen) erst in den letzten 10 Jahren stärker umgesetzt worden.

Dabei ist eine Standardisierung nicht zuletzt im Rahmen qualitätssichernder Maßnahmen bei Arbeiten unter GLP- oder GMP-Bedingungen erforderlich geworden. Mit zunehmenden Erkenntnissen aus der Forschung in der Rege-nerativen Medizin, der somatischen Zelltherapie

Mit der zunehmenden Bedeutung der somati-schen Zelltherapie und neuen Möglichkeiten der Gewebezüchtung sind die Anforderungen an eine Standardisierung bei der Gewinnung und Herstellung von Stammzellen gestiegen. Wichti-ge Faktoren sind dabei die Art der Stammzellen (hämatopoetische, mesenchymale), der Grad der Differenzierung und die geplante Anwendung

(allogener oder autologer Einsatz). Bei Zugrun-delegen des Herstellungsbegriffs aus regulato-rischer Sicht umfasst das „Manufacturing“ alle Schritte von Gewinnung, über Herstellung bis zur Freigabe und Auslieferung der Zellen zum Endverbraucher (Klinik, Zellbank oder Kunde).

Auch in den Einrichtungen der Grundla-genforschung ist die Erkenntnis gereift, dass

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sind die weiteren Kultivierungsschritte der Stammzellen identisch. Auch morphologisch und rein lichtmikroskopisch sind zwischen den Zellen keine großen Unterschiede zu erkennen (Abb. 1).

In der Literatur lassen sich keine Hinweise auf eine unterschiedliche therapeutische Effizienz der mesenchymalen Stammzellen für die Behandlung von Sehnen- oder Band-verletzungen beim Pferd oder Hund finden. Klassische klinische Studien liegen noch nicht vor, so dass nur auf Synopsen verschiedener Anwendungsbeobachtungen zurückgegriffen werden kann.

Die Herstellung equiner mesenchymaler Stammzellen ist mittlerweile standardisiert und an GMP-Bedingungen angeglichen. Für

Abb. 2: Aufbau eines für verschiedene Umgebungsbereiche qualifizierten Transportbehälters9

Summer

+22°C to 10°C ramped over 12 h+10°C to 22°C ramped over 12 hRepeat to 48 h

ResultsProduct temerature+2°C to 8°C over 48 hMaximum temperature 8°C @ 48 h

Winter

+14°C to 5°C ramped over 12 h+5°C to 14°C ramped over 12 hRepeat to 48 h

ResultsProduct temerature+2°C to 8°C over 48 hMaximum temperature 7.5°C @ 48 h

Abb. 1: Morphologie equiner mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark, Fettgewebe und Nabelschnurblut (aus [5])

Tab. 2: InProzessKontrollen

Antigen Expression

CD14 Positiv (++)

CD34 Positiv (++)

CD45 Schwach positiv (+)

CD73 Negativ (–)

CD90 Negativ (–)

CD105 Positiv (+++)

CD160 Negativ (–)

Tab. 1: Marker für die Charakterisierung equiner mesenchymaler Stammzellen in der Durchflusszytometrie (nach [8])

In-Prozess-Kontrolle

Pharm Eur-Kapitel

Vitalität Pharm. Eur. monograph 2.7.29

Sterilität Pharm. Eur. monograph 2.6.1

Endotoxin Pharm. Eur. monograph 2.6.14

Mycoplasmen Pharm. Eur. monograph 2.6.7

und der Gewebezüchtung (Tissue engineering) haben sich die Anwendungsgebiete in Human- und Veterinärmedizin stark erweitert. So wird der Einsatz von Stammzellen zur Geweberege-neration in nahezu jeder medizinischen Disziplin diskutiert und geprüft. Der Gesetzgeber hat dieser Entwicklung in seiner höchsten Ausprä-gung mit den Bestimmungen zur Herstellung von Arzneimitteln für neuartige Therapien Rechnung getragen1-4.

Zu berücksichtigende Parameter und Vorgehensweise

Am Anfang der Produktentwicklung sollte ein „Workshop“ stehen, in dem der gesamte Prozess hinsichtlich seiner Risiken und Einzelschritte analysiert wird. Gleichzeitig müssen Anforde-rungen an das Endprodukt definiert und festge-halten werden. In diesem ersten Schritt haben sich Methoden wie die des Mindmappings bewährt; sie sind offen, parallel verschiedene Aspekte des Prozesses zu berücksichtigen.

Hieraus leitet sich dann ein erster Prozessflow ab, in dem einzelne Prozessschritte mit den je-weiligen Anforderungen an Ausgangsprodukte, Geräte und Personal abgebildet werden.

Fragen, die ferner zu klären sind, behandeln den Ort der Gewinnung (z.B. OP, Pathologie, in der Veterinärmedizin auch der Stall), die Temperaturbedingungen, die Art und Zu-sammensetzung des Transportmediums und die erforderlichen Transportbedingungen. Wichtig ist auch die Klärung der Frage der längstmöglichen Transportdauer, ohne dass es zu Einschränkungen in der Qualität der Zellen kommt. Empfehlenswert ist es, schon auf die-ser Stufe eine Risikoanalyse durchzuführen, deren Ergebnis unter anderem notwendige In-Prozess-Kontrollen und die Freigabe relevanter Parameter sind.

Abhängig vom späteren Einsatz der Stamm-zellen sind in einem weiteren Schritt die erforderlichen Verarbeitungsbedingungen zu organisieren. Ist eine therapeutische An-wendung lebender Zellen geplant, sind asep-tische Produktionsbedingungen (Reinraum oder Isolator) zu wählen. Damit verbunden sind Aufwendungen und Maßnahmen für die Aufrechterhaltung der Produktionsbe-dingungen (Zonenkonzept, Hygienekonzept, regelmäßige Wartung, Schulung etc.). Neben der eigentlichen Arbeit im Labor beziehungs-weise Reinraum sind Personal und Zeit für die

Dokumentation und die Qualitätssicherung zu berücksichtigen.

Am Ende des Produktionsprozesses steht ein Zellprodukt, das hinsichtlich seiner Reinheit, Vitalität, Haltbarkeit, Tumorigenität, Immuno-genität und Wirksamkeit bestmöglich charak-terisiert ist.

Anwendungsbeispiel: Gewinnung von equinen mesenchymalen Stammzellen

Beispielhaft soll hier die Gewinnung equiner mesenchymaler Stammzellen dargestellt wer-den. Als Zellquelle kommen das Knochenmark, das Fettgewebe und das Nabelschnurblut in Frage. Jedes dieser Ausgangsmaterialien stellt seine eigenen Anforderungen an die Gewinnung, die verwendeten Materialien und Geräte für die Gewinnung sowie die Aufrecht-erhaltung aseptischer Bedingungen. Während das Knochenmark mittels Punktion aus dem Brustbein oder dem Beckenkamm gewonnen wird, lassen sich die Stammzellen aus dem Fettgewebe über Absaugung oder Entnahme größerer Gewebestücke (z.B. kastaniengroß) und anschließender Abtrennung der Fettzellen isolieren. Die Gewinnung von Nabelschnurblut hat hingegen die spezifischen Bedingungen der Geburt zu berücksichtigen.

Nach Anreicherung der Zellen über Dichte-gradientenzentrifugation und Plastikadhärenz




eventuell erforderliche In-Prozess-Kontrollen sind durchflusszytometrische Analysen geeig-net, und entsprechende Protokolle stehen für human- und veterinärmedizinische Bereiche zur Verfügung.

Weitere mögliche In-Prozesskontrollen sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Dabei sind die Anforderungen des Europäischen Arzneibuchs zu erfüllen.

Ein wichtiger Schritt im Rahmen der Stan-dardisierung der Herstellung der Stammzellen ist die Qualität der verwendeten Medien und Reagenzien. Auch wenn einige Zusätze und Faktoren nicht unter GMP oder arzneimit-telrechtlichen Gesichtspunkten hergestellt werden, hat sich das Angebot an GMP-kon-formen und für die Zelltherapie verwendba-ren Medien vergrößert. Eine vertrauensvolle Kommunikation mit den Herstellern ist dabei von entscheidender Bedeutung und kann viel Zeit in Anspruch nehmen. Insbesondere sind Informationen zur Abschätzung möglicher

Risiken durch TSE oder auch der virologischen Sicherheit erforderlich, zum Beispiel über die Abwesenheit beziehungsweise Inaktivierung von porcinen oder bovinen Viren. Dies betrifft auch die Herstellung von Einzelkomponenten der Medien (z.B. Aminosäuren) im Rahmen von Fermentationsprozessen.

Der Transport des Endproduktes erfolgt in dazu qualifizierten Transportbehältern (Abb. 2) entweder in geschlossenen Beuteln oder in den vorbereiteten Röhrchen oder Spritzen zusammen mit den Analysezertifikaten und schriftlichen Hinweisen zur bestimmungs-gemäßen Verwendung (Gebrauchsanwei-sung).

Referenzen

[1] Verordnung (EU) 1394/2007[2] Direktive 2006/17/EC[3] Direktive 2006/86/EC[4] EU-GMP Leitfaden

[5] Brehm, W. (2006). Stammzellen, Stammzelltherapie - Be-griffserklärung, Zusammenhänge und mögliche klinische Anwendungen. Pferdeheilkunde 22, 259-267.

[6] Smith, R., Young, N., Dudhia,J., Kasashima, Y., Clegg, P.D., and Goodship, A. (2009). Effectiveness of bone-mar-row-derived mesenchymal progenitor cells for naturally occurring tendinopathy in the horse. World Conference on Regenerative Medicine. Regen.Med.Suppl.Nov.2009,Vol.4, No.6 (Suppl.2), Ref Type: Conference Proceeding

[7] Ribitsch I., Burk J., Delling U., Geißler C., Gittel C., Jülke H., Brehm W. (2010) Basic science and clinical application of stem cells in veterinary medicine, Adv Biochem Eng Biotechnol. 2010;123:219-263.

[8] Braun, J; Hack, A; Weis-Klemm, M; Conrad, S;Treml, S; Kohler, K; Walliser, U; Skutella, Th; Aicher, W. (2010) Eva-luation of the osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of equine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. AJVR, 71:1-9.

[9] www.sca-cool-logistics.com


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Auf der World Conference on Regenerative Medicine 2011, 2. – 4. November in Leipzig, werden etwa 1.000 internationale Teilneh-mer aus Forschung, Klinik und Wirtschaft über Fachgrenzen hinaus die neuesten Erkenntnisse und Anwendungen der Rege-nerativen Medizin diskutieren. Insbesondere Vorträge zu den Herstellungsmethoden von pluripotenten Stammzellen und deren Poten-tial für therapeutische Anwendungen wer-den mit Spannung erwartet (Andras Nagy, Kun Zhang). Auch veterinärmedizinische For-

schungsarbeiten bieten Gesprächsstoff (Roger Smith). Deren Ergebnisse liefern wertvolle präklinische Daten, die der Humanmedizin als Basis für weitere Entwicklungen dienen können. Ein vielseitiges Rahmenprogramm mit Industrieausstellung, Networking-Events und einer Veranstaltung in Europas größter Tropenhalle „Gondwanaland“ gewährleistet einen interdisziplinären Austausch.

Infos und Registrierung unter: www.wcrm-leipzig.com

Laborwelt Hintergrund

Internationales Treffen der Stammzellforschung und Regenerativen Medizin



Wissenschaft Technologietransfer

Zelltechnik-Innovationen für die IndustrieDr. Anja Rasch, Gesellschaft für Industrielle Zelltechnik e.V., Norgenta Lübeck an der Fraunhofer-Einrichtung für Marine Biotechnologie (EMB), Lübeck

Ob Stammzelltechnologie, Zelltracking, Herstellung von Biomaterialien, Aquakultur, Inkubatoren oder zellbasierte Systeme zur Arzneimitteltestung – die neugegründete Deutsche Gesellschaft In-dustrielle Zelltechnik e. V. (www.industrielle-zelltechnik.de) will das Know-how von Forschern und Unternehmen bündeln, um innovative Plattformtechnologien der Zelltechnik in die Anwendung zu überführen. Im Vordergrund stehen dabei die Translation komplexer 3D-Zellkultursysteme, Analy-setechnologien, die Herstellung von Instrumenten und Materialien (z.B. Biomimetika/intelligente Scaffolds) für biomedizinische, medizintechnische und lebensmitteltechnologische Anwendungen. Die interdisziplinäre Vernetzung und Zusammenarbeit der Akteure, gemeinsame Veranstaltungen, die Förderung des Fachkräfte-Nachwuchses und eine internationale verbesserte Wettbewebsfä-higkeit bei biomedizinischen Innovationen sind erklärte Ziele der auf dem 2. Kongress „Industrielle Zelltechnik“ Anfang September in Lübeck ins Leben gerufenen Interessenvertretung. Unter den zehn Gründungsmitgliedern (vgl. Foto) der administrativ von der Norddeutschen Life Science Agentur Norgenta geführten Gesellschaft befindet sich auch der Biotechnologie-Unternehmensverband BIO Deutschland. Dieser wird die fachpolitischen Interessen der beteiligten Forscher und Firmen übernehmen. In diesem Beitrag werden exemplarisch einige der an der Fraunhofer-EMB entwickelten und auf dem Kongress präsentierten Innovationen vorgestellt.

ler das Zelltracking mittels einer Software nun vollständig automatisieren: Eine systematische Fehlersuche überprüft dabei die Trackingresul-tate und nur vertrauenswürdige Ergebnisse werden an den Experimentator weitergereicht. Aus diesen lassen sich statistisch signifikante Parameter und Merkmalsbündel (sog. Deskrip-toren) berechnen, die die eindeutige Identifikati-on und Qualitätskontrolle von Zellpopulationen eröffnen. Das Verfahren ermöglicht Aussagen zu Lebenszeitverteilungen, Teilungssymmetrie, Migrations- und Wachstumsverhalten, den inneren Zellbewegungen und Zellformen sowie das automatische Auffinden von proliferativen „hot spots“. Unlängst berichteten Becker et al.1 über die Nutzung der Zelltracking-Software zur automatischen Detektion teilungsaktiver, kultivierter, adulter Stammzellen durch das „Tra-cking“ morphologischer Veränderungen..

Kokultivierungstechnologie

Aus Stammzellen differenzierte Zelltypen versprechen langfristig einen Einsatz in der regenerativen Medizin, kurzfristiger aber als Zellmodelle, zum Beispiel in der Arzneimit-telforschung. Allerdings sind heute geläufige Kultivierungsverfahren auf Basis der sequen-tiellen Zugabe von Wachstumsfaktoren und Zytokinen zum Kulturmedium mit hohem Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Ein von der EMB-Arbeitsgruppe „Zelldifferenzierung“ entwickeltes Verfahren (Petschnik et al.)2 setzt stattdessen auf die Kokultur humaner Stamm-zellen mit lebenden Biopsien aus Säugergewe-be. Die von diesen Geweben ausgeschütteten Faktoren induzieren dabei die Differenzierung in das entsprechende Zielgewebe. Mit einem indirekten Kokultursystem, gelang bereits eine neurale Differenzierung. Zwei Tage nach indirekter Kokultur von humanen Stammzell-populationen aus Haut oder Pankreas mit Gewebebiopsien aus Rattenhirn betrug die

Besonders das Feld der Stammzellkultur und -differenzierung könnte vom Verfahren der optischen Zeitraffermikroskopie profitieren, das durch eine am Fraunhofer-EMB entwickelte Software nun erstmals die automatisierte mik-roskopische Überwachung in vitro kultivierter Einzelzellen gestattet. In Abständen von 1-15 Minuten werden dabei die Zellen während des Wachstums in der Kulturschale mit einem

automatisierten Mikroskop aufgenommen, das durch aktive Fokusnachführung so stabil ist, dass es zuverlässige Zellbeobachtungen über viele Tage erlaubt. Bisherige Analysen der Bilderfolgen erforderten stets die manuelle Überwachung der Zellen mit Auge und Hand, was einen enormen Aufwand bedeutet und keine durchgängige Zuverlässigkeit garantiert. An der Fraunhofer-EMB konnten Wissenschaft-

Abb. 1: Die Gründungsmitglieder der Deutschen Gesellschaft für Industrielle Zelltechnik und Wolfgang-Dieter Glanz (3. v. rechts) vom Ministerium für Wissenschaft, Wirt-schaft und Verkehr des Landes Schleswig-Holstein (v. l. n. r.): Prof. Dr. Ralf Pörtner (TU Hamburg-Harburg), Dr. Oskar-W. Reif (Sartorius Stedim Biotech GmbH), Dr. Cordula Kroll (Eppendorf AG), Rüdiger Schacht (IHK Lübeck), Dr. Mira Grättinger (European ScreeningPort GmbH), Dr. Oliver Wehmeier (CCS Cell Culture Service GmbH), Dr. Viola Bronsema (BIO Deutschland e.V.), Dr. Kathrin Adlkofer (Norgenta Norddeutsche Life Science Agentur GmbH) Prof. Charli Kruse (Fraunhofer-EMB)

Abb. 2: Innovativer Zelltransporter: Einen zellschonenden Transport ermöglicht eine autarke, am Fraunhofer-EMB entwickelte Minitransportbox. Der zum Patent angemeldete Container hält Standardbedingungen für Zell-kulturen (37°C, 5% CO2) über 48 h konstant und protokolliert die gere-gelten Größen.

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Wissenschaft Technologietransfer

Abb. 3: Stammzellen aus dem Pankreas be-siedeln die flexiblen Sonden. Phalloi-din färbt den Zellkörper rot und DAPI die Zellkerne blau. Das Sondenmate-rial erscheint durch die Eigenfluores-zenz pink.

Ausbeute an Zellen mit Nervenzellmorphologie und -markern 12%.

Zellcoating schützt Neuroprothesen

Eine große Herausforderung bei der Implantati-on sogenannter Hirnschrittmacher zur Therapie psychomotorischer Bewegungsstörungen wie Parkinson und psychischen Erkrankungen wie schweren Depressionen ist die dauerhafte Inte-gration impulsgebender Elektroden im Gehirn. Infolge kleinster Verletzung bei Einführen starrer Elektroden kommt es zu einer Aktivierung der immunologisch aktiven Mikrogliazellen und Astrozyten, die das Einwachsen des Implantats in das Hirngewebe stören. Aktuelle Arbeiten deuten auf den Nutzen flexibler, mit körperei-genen Stammzellen und Hydrogel beschichte-ten Elektroden zur Tiefenhirnstimulation hin. Ziel dabei ist es, die Immunreaktion durch die in-vivo-Differenzierung der Stammzellen in körpereigene Nervenzellen zu minimieren und damit die Biokompatibilität und Gewebeinte-gration der Elektrode zu verbessern. Richter et al.3 setzten dazu flexible Elektroden ein, deren Elektrodenmaterial außer an den Stimulations-punkten, von einer Polyimidhülle umgeben ist. Auf dem Kunststoffmantel immobilisierten sie glanduläre Stammzellen aus Acinuszellen des Pankreas. Erste Tests zeigen, dass die Stamm-zellen ihre Differenzierungsfähigkeit auch nach Immobilisierung behielten. Zudem konnte de-monstriert werden, dass das Aufbringen eines Hydrogels auf die Zellen, der Zellabrasion bei Einführen der Elektroden wirksam entgegen-wirkt. In derzeit laufenden Untersuchungen konnte belegt werden, dass die Schutzschicht weder die Zellmigration noch die Zellteilung beeinträchtigt. Tierversuche sollen bisher welt-weit fehlende Daten zur Langzeitintegration der Elektroden liefern.

Marine Biotechnologie

Der Fisch gilt aufgrund seines hohen Regene-rationspotentials als geeignetes Modell, zum Beispiel in der Herzforschung. Wissenschaftler der Fraunhofer-EMB haben ein Testsystem aus Fischzellen entwickelt, bei dem über lange Zeit autonom kontrahierende 3D-Herzzellaggregate in vitro generiert werden4. Analysen mittels Immunhistochemie, PCR und Elektronenmik-roskopie belegen die Existenz von Molekülen

Abb. 4: Aus Forellenlarven differenzierte Herzmuskelzellen ähneln humanen Kardiomyozyten viel mehr als Mausherzzellen6,7. Nutzen wollen Forscher dies bei der Bestimmung der Herztoxizität von Wirkstoffen in zellbasierten Testsystemen, zum Beispiel auf Basis von Multielektroden-Arrays (siehe Bild).

und Strukturen vollentwickelter Herzzellen, die wie im Herzorgan über Zell-Zellverbindungen miteinander verbunden und elektrisch ge-koppelt sind. Weiterhin konnte die spontane Kontraktion durch ein Schrittmacherzentrum geklärt werden. In weiteren Untersuchungen wurden die elektrophysiologischen Eigen-schaften der aus Fischzellen differenzierten Herzzellen untersucht. Das in vitro-Modell weist wie alle Herzzellen in Fisch eine schnelle Depolarisation, eine ausgeprägte Plateauphase und eine schnelle Repolarisation auf, die dem Aktionspotential von humanen Herzzellen ähnelt. Des Weiteren konnten Grunow et al.5

die Sensitivitäten von zwei Ionenkanälen des Herzens gegenüber Arzneimittelkandidaten

belegen, die auch in humanen Kardiomyozyten vorhanden sind. Diese Aggregate können relativ einfach in großen Mengen hergestellt werden, da dazu keine Wachstumsfaktoren erforderlich sind. Aufgrund ihres dem Menschen ähnlichen Aktionspotentials könnten sie als human-relevantes Herzmodell eingesetzt werden.

Literatur

[1] Becker et al. Adaptive Mitosis Detection in Large in vitro Stem Cell Populations using Timelapse Microscopy. Proc. Bildvera-beitung für die Medizin (BVM), Luebeck, Germany, Informatik aktuell, pp. 49-53, 2011

[2] Petschnik et al. A novel xenogeneic co-culture system to examine neuronal differentiation capability of various adult human stem cells. PLoS One. 2011; 6(9): e24944

[3] Richter et al. Frontiers in Neuroprosthetics, (2011). Cellular modulation of polymeric device surfaces: promise of adult stem cells for neuroprosthetics. Front. Neurosci. 5:114. doi: 10.3389/fnins.2011.00114

[4] Grunow et al. In vitro developed spontaneously contracting cardiomyocytes from rainbow trout as a model system for human heart research. Cellular Physiology and Biochemistry (2011) 27, 01-12

[5] Grunow et al. In vitro expansion of autonomously contracting, cardiomyogenic structures from rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Journal of fish biology (2010) 76, 427-434

[6] Berghmans et al. Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual and gut funtion-potential safety screen for early drug discovery. J Phamacol Toxicol Methods 2008; 58: 59-68

[7] Brette et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochem Biophys Res Com-mun 2008; 374:143-146


Dr. Anja Rasch.Deutsche Gesellschaft Industrielle [email protected] www.industrielle-zelltechnik.deinfo@emb.fraunhofer.dewww.emb.fraunhofer.de

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Blitzlicht Durchflusszytometrie

Durchflusszytometrie: Kompaktklasse für ZellanalysenJason Whalley, Merck Millipore

Genomstudien haben dazu beigetragen, zahlreiche Krankheitsanfälligkeitsgene und Genexpres-sionsprofile – sogenannte genetische Signaturen – zu entdecken. Die im Rahmen dieser Unter-suchungen gesammelten Informationen helfen nicht nur bei der Vorhersage des statistischen Erkrankungsrisikos des einzelnen Patienten, sondern sie dienen auch als Richtlinie für therapeuti-sche Entscheidungen. Obwohl die Genomforschung unser Verständnis der molekularen Basis von Krankheiten ständig erweitert, sind diese Studien allein nicht ausreichend, die ganze Komplexität von Krankheitsprozessen zu erfassen. Die Post-Genom-Ära ist auch von der Notwendigkeit ge-prägt, das Proteom zu analysieren. Dies ist die nächste große Herausforderung auf dem Weg zum Verständnis der an Gesundheit und Krankheit beteiligten biologischen Prozesse. Denn Proteine sind die entscheidenden molekularen Akteure, die sowohl die physiologischen als auch pathophy-siologischen Vorgänge steuern.

der Anwendung sind. Diese Methoden konzen-trieren sich jedoch auf einzelne Proteine, was einen limitierenden Faktor für Forscher darstellt, die versuchen, die komplexen Netzwerke der Interaktionen und Signalkaskaden zu enträtseln, um die molekularen Grundlagen von Krankhei-ten zu verstehen. Die Erforschung bestimmter, einzelner Proteine muss daher durch Techniken ergänzt werden, die die Untersuchung des interessierenden Proteins innerhalb seines biologischen Kontextes ermöglichen.

Technik der Wahl zur Erforschung der Proteine

Die Durchflusszytometrie ist eine Technik, bei der die in einem Flüssigkeitsstrom suspen-dierten Zellen optisch analysiert werden. Diese Technik bietet die Möglichkeit, Daten von ein-zelnen Zellen, die sich in einer gemischten Probe befinden, zu sammeln und in jeder Sekunde gleichzeitig zahlreiche Parameter tausender Zellen zu messen. Die simultane Messung zahlreicher Proteine pro Zelle liefert im Vergleich zu anderen Methoden der Proteindetektion bessere prädiktive und quantitative Daten. Aus diesem Grund ist die Durchflusszytometrie für das gesamte Spektrum der Zellforschung rasch zur Technik der Wahl geworden und wird in der Klinik bereits routinemäßig zur Unterstützung der Diagnose bei Blutkrebs eingesetzt.

Trotz der Vorteile der Durchflusszytometrie für multiparametrische Untersuchungen blieb der Einsatz der Technologie aufgrund der damit verbundenen Kosten, der komplexen Testentwicklung, des Platzbedarfs und des War-tungsaufwandes bisher auf große Laboratorien und mit Experten besetzte Zentren beschränkt. Forscher, die sich der Durchflusszytometrie be-dienen wollen, müssen in der Regel bestimmte Zeiten in Core Facilities für ihre Experimente reservieren, die Proben entsprechend für den Transport vorbereiten und sich für deren Ablie-ferung von einem Ende des Forschungsgeländes zum anderen bewegen oder sogar die ganze Stadt durchqueren. Außerdem sehen sich die Forscher aufgrund der wachsenden Popularität des Verfahrens zunehmend mit anderen Grup-pen konfrontiert, mit denen sie in den großen Durchflusszytometrie-Laboratorien um den Zugang zu den entsprechenden Instrumenten konkurrieren.

Entwicklung zum kompakten Tischgerät

Mit der Entwicklung des Durchflusszytometers als Tischgerät sind diese Hindernisse nunmehr überwunden. Das Tisch-Durchflusszytometer ermöglicht auch den kleinsten Labors mit begrenztem Budget die Durchführung von komplexen Zellanalysen, wann immer diese benötigt werden. In Kombination mit einer benutzerfreundlichen Software und optimier-ten, kompletten Testkits können Experten und

Biologie ist extrem komplex und die Translation der Gene in Proteine kein einfacher Prozess. Gen expressionsprofile repräsentieren nicht exakt das, was sich auf der Ebene der Prote-ine ereignet, weil zwischen dem Niveau der Genexpression und der daraus resultierenden Proteinexpression keine direkte Korrelation be-steht. Ein Gen kann also viele Proteine kodieren. Tatsächlich umfasst das menschliche Genom nur 21. 000 proteinkodierende Gene, obwohl es schätzungsweise zwischen 250.000 und einer Million Proteine enthält. Proteine sind dynamische Strukturen, die kontinuierlich mit anderen Proteinen in Interaktion treten oder post-translationalen Modifikationen (PTM) wie Phosphorylierung, Glykosylierung, Lipidierung und Spaltung unterliegen. Post-translationale

Proteinmodifikationen und Protein-Protein-Interaktionen spielen bekanntlich eine wichtige Rolle bei Krankheitsprozessen und könnten als krankheitsspezifische Biomarker sowie als therapeutische Zielmoleküle dienen. Proteine liegen im Körper zudem in einem weiten Kon-zentrationsbereich vor. Zusammen schaffen alternatives Gen-Spleißen, post-transkriptionale Genregulation und post-translationale Modifi-kationen ein komplexes, dynamisches Muster der Proteinexpression.

Die in den 1970er Jahren entwickelten Un-tersuchungsverfahren Western Blot und ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) zählen nach wie vor zu den am häufigsten verwende-ten Testverfahren, da sie sich als verlässlich und kosteneffektiv erwiesen haben und einfach in

Abb. 1: Das guava-Durchflusszytometrie-System passt auf jeden Labortisch.

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Blitzlicht Durchflusszytometrie

Anfänger der Zellbiologie gleichermaßen die Durchflusszytometrie im eigenen Labor durch-führen. Durchflusszytometrie-Tischgeräte ha-ben viele Vorteile, unter anderem eine schnelle Assayentwicklung, geringe Kosten, eine hohe Flexibilität, die Möglichkeit zur gleichzeitigen Analyse mehrerer Datensätze und eine einfache Detektion dank benutzerfreundlicher Software. Zudem ermöglichen die Tischgeräte die direkte Integration der Durchflusszytometrie in das Forschungsszenario und die Arbeitsabläufe der Proteinexpressionsanalyse.

Die neuen Mikrokapillar-Durchflusszytometer eignen sich besonders gut zur Verwendung als Tischgerät. Sie arbeiten mit kleineren Pro-benvolumina, erzeugen weniger Abfall, ver-ursachen niedrigere Betriebskosten und sind einfacher einzurichten und zu bedienen als handelsübliche Durchflusszytometriegeräte. Die Tisch-Durchflusszytometer ermöglichen die Durchführung breit gefächerter, komplexer Experimente, von der Zwei-Farben-Detektion in einer einzigen Zellprobe bis zur Sechs-Farben-Detektion bei multipler Probennahme aus Röhr-chen oder 96-Well-Platten. So kann das neueste guava-Gerät von Merck Millipore, das guava easyCyteTM 8HT Tisch-Durchflusszytometer (Abb. 1), bis zu acht Zellparameter gleichzeitig analysieren.

Durchflusszytometrie-Tischgeräte werden immer mehr zum unverzichtbaren Forschungs-instrument für Wissenschaftler, die sich auf der Suche nach neuen therapeutischen Ansatz-punkten für Medikamente mit der Analyse von Signalwegen befassen. Signalwege steuern die zentralen zellulären Prozesse, einschließlich Apo-ptose, Zelldifferenzierung, Zellwachstum und Zellproliferation, die alle an der Entwicklung von Krebs und anderen Krankheiten beteiligt sind. Im Gegensatz zu den Methoden, die sich auf ein einziges Protein konzentrieren, können bei der Durchflusszytometrie gleichzeitig mehrere Schlüsselproteine und deren Aktivierungszu-stände bzw. Interaktionen analysiert werden. Dadurch kann eine Korrelation zwischen Akti-vierung eines Weges und Veränderungen in der Zellfunktion hergestellt werden.

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie lassen sich diese Parameter auch innerhalb einer heterogenen Zellpopulation analysieren. Zur Charakterisierung gemischter Zellpopulationen ist eine Messung des Gesamtproteinspiegels quer durch die gesamte Zellpopulation unge-eignet, da sich die relative Expression und/oder Signal ereignisse in den einzelnen zellulären Subpopulationen unterscheidet. Die Fähigkeit, eine quantitative Unterscheidung zwischen den Proteinexpressionsprofilen verschiedener Subpopulationen von Zellen treffen zu können und die zugrundeliegenden komplexen zellulä-ren Signalwege identifizieren zu können, ist eine absolute Voraussetzung für das Verständnis der fundamentalen Grundlagen von Krankheiten sowie die Verbesserung der Chancen auf eine erfolgreiche Entwicklung von neuen Medika-menten.

Abb. 2: Die Heatmap-basierten Analyse-pakete ermöglichen die gleichzeitige Analyse von bis zu acht Parametern für 96 Proben in einem einzigen Durchgang.

Benutzerfreundliche, flexible und integrierte Plattform

Der Einzug der Durchflusszytometrie in indivi-duelle Labors fördert einen spontaneren und fle-xibleren Zugang zur Zell- und Proteinanalyse. So können zum Beispiel die Durchflusszytometrie-Experimente je nach den von Kollegen im selben Labor erhaltenen Ergebnissen rasch modifiziert werden. Umgekehrt können die mit dem Tisch-Durchflusszytometer erhaltenen Daten sofort von den Kollegen in ihre experimentellen Ent-würfe integriert werden, wodurch eine starke Synergie entsteht, die den Forschungsprozess vorantreibt.

Ein eigenes, spezielles Tisch-Durchflusszyto-meter kann auch, auf dieser Technik beruhende,

sich wiederholende Analysen beschleunigen. Wissenschaftler müssen oft zahlreiche durch-flusszytometrische Analysendurchgänge durchführen, egal ob dies für die Wahl einer stabilen fluoreszierenden Reporter-Zelllinie oder eines Hybridoms, das die höchste Konzentration eines besonders fest bindenden Antikörpers produziert, erforderlich ist, oder ob es um groß-angelegte, gepoolte siRNA-Screens geht. Es ist daher schwierig, Experimente weit im Voraus zu planen, da es häufig erforderlich ist, Zeiten in ei-ner zentralen Durchflusszytometrie-Einrichtung zu reservieren, insbesondere wenn das Testpro-tokoll jeder Runde aber von den Ergebnissen des vorherigen Durchgangs abhängt. Im Gegensatz dazu können dank der Tisch-Durchflusszytome-ter die Experimente beginnen, sobald sie geplant und entworfen sind.

Integrierte Plattformen mit Geräten, kom-pletten Testkits und optimierter Software ver-setzen jeden Wissenschaftler in die Lage, sich für die Zell analyse der Durchflusszytometrie zu bedienen, auch dann, wenn er mit dieser Technik noch keine Erfahrung hat. Ein breites Angebot an spezifischen Reagenzienkits – va-lidiert für die Verwendung mit Tisch-Durch-flusszytometern für verschiedene Tests wie Apoptose, Zellzahlen, Lebensfähigkeit von Zel-len, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und

Zytotoxizität, Chemokinrezeptorkonzentration, Signaltransduktion und Stammzellenphäno-typen – steht zur Verfügung. Da alle Reagen-zien (außer Zellen) in den Kits enthalten sind, entfällt der Zeitaufwand für die Entwicklung eigener Assays. Zudem ermöglichen Assay-spezifische Software-Module den Forschern, wichtige Daten rasch zu erhalten, indem nur die relevanten Plots und Statistiken angezeigt werden und nur eine minimale Intervention von Seiten des Benutzers erforderlich ist. Aufgrund der großen Datenmengen, die bei Durchflusszytometrie-Experimenten erhalten werden, und infolge des höheren Probendurch-satzes kann es auch bei der Datenanalyse zu Engpässen kommen. Um dies zu vermeiden, stehen Heatmap-basierte Analysepakete zur Verfügung, die eine gleichzeitige Analyse von bis zu acht Parametern für 96 Proben in einem einzigen Durchgang ermöglichen. Diese Analyse option ist für die guava-Durchflusszy-tometrie-Plattform erhältlich (Abb. 2).

Unter den neuen Anwendern der Durch-flusszytometrie sind unter anderem auch Wis-senschaftler, die sich auf die Erforschung von Algenstämmen zur potentiellen Verwendung für die Biokraftstoffproduktion konzentrieren, wofür Tisch-Durchflusszytometer einfacher und praktischer sind. Dank der Verwendung von lipidbindenden Fluoreszenzfarbstoffen anstelle von biochemischen Bestimmungs-methoden ist es für diese Biokraftstoff-For-schungslabors viel einfacher, Algenstämme mit hohem Lipidgehalt und großer Zelldichte auszuwählen.

Schlussfolgerung

In dem Maße, in dem sich Wissenschaftler der Leistungsfähigkeit von Tisch-Durchflusszyto-metern bewusst werden, wird auch die Nach-frage nach spezifischen Assays für bestimmte Zelltypen und biologische Wege steigen. Um dieser Nachfrage gerecht zu werden, sind wei-tere Reagenzien-Kits sowie die entsprechende begleitende Software für die Durchflusszytome-trie-Tischgeräte bereits in Entwicklung. Damit werden den Forschern in den verschiedenen Bereichen der Life Science für die unterschied-lichsten Anwendungen einschließlich der Arzneitmittelentwicklung Komplettlösungen angeboten. Jeder Wissenschaftler, der sich für seine spezielle Forschungstätigkeit der Durch-flusszytometrie bedienen möchte, kann dies nun tun, und zwar auch ohne Erfahrung mit dieser Technik zu haben und ohne Anleitung durch einen Experten.


Jason WhalleySenior Product ManagerMerck [email protected]

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Wissenschaft Neurowissenschaften

Bidirektionale Kontrolle der Angst durch den CRH-Rezeptor Typ 1Dr. rer. nat. Jan M. Deussing, Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Dr. h.c. Florian Holsboer; Max-Planck-Institut für Psychiatrie, München

Das Corticotropin-releasing Hormone (CRH) und sein Typ 1-Rezeptor (CRHR1) spielen eine Schlüssel-rolle bei der Koordination der Stressantwort. Fehlregulationen dieses Systems sind ursächlich für die Entstehung von Stress-abhängigen Erkrankungen wie etwa Depressionen und Angststörungen verantwortlich. Mit Hilfe histochemischer Methoden und genetischer Mausmodelle konnten wir erstmalig die Identität von CRHR1-exprimierenden Neuronen im Gehirn der Maus im Detail aufklären. Der CRHR1 ist insbesondere auf Neuronen des Vorderhirns lokalisiert, die Glutamat als Neurotransmitter verwenden (glutamaterge) sowie auf Dopamin-produzierenden (dopaminergen) Neuronen des Mittelhirns. Konditionale Knockout-Mäuse zeigen, dass der CRHR1 Angstverhalten bidirektional in Abhängigkeit von seiner Lokalisation in glutamatergen (Angst erzeugend) und dopaminergen Neuronen (Angst lösend) kontrolliert. Gleichzeitig moduliert der CRHR1 direkt die Glutamat-abhängige Neurotransmission sowie die Ausschüttung von Dopamin. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass möglicherweise ein Ungleichgewicht zwischen CRHR1-kontrollierten glutamatergen und dopaminergen Systemen eine wichtige Rolle bei der Entstehung psychischer Erkrankungen spielt und eröffnet zugleich Perspektiven für spezifischere Therapieansätze.

Fehlregulation als eine mögliche Ursache für die Entstehung und Pathophysiologie Stress-abhängiger Erkrankungen nahelegen, wie zum Beispiel Depressionen und Angststörungen. So wurden zum Beispiel in Post-mortem-Studien in depressiven Patienten eine erhöhte Anzahl von CRH-produzierenden Neuronen im Hypo-thalamus sowie ein erhöhter CRH-Spiegel in der Cerebrospinalflüssigkeit gefunden, der sich nach erfolgreicher Therapie wieder normali-sierte. Außerdem finden sich im präfrontalen Kortex von depressiven Patienten weniger CRH-Bindungsstellen. Dies deutet auf erhöhte CRH-Konzentrationen im Gehirn hin3.

Genetische Mausmodelle haben einen wichti-gen Beitrag zum Verständnis der in-vivo-Funkti-on des CRH/CRHR1-Systems geleistet. Transgene Mäuse, die das CRH im Gehirn überexprimieren, zeigen im Verhalten und in der neuroendokrinen Antwort eine erhöhte Reaktivität auf Stress4. Zudem zeigen diese Tiere Veränderungen in ihrer Schlafarchitektur und -qualität, analog zu Befunden bei depressiven Patienten5. Eine Überexpression – beschränkt auf das limbische System – führt ebenfalls zu Schlafstörungen und einer erhöhten Ängstlichkeit5,6. Umgekehrt zei-gen konstitutive CRHR1-Knockout-Mäuse neben einer gestörten HHN-Achsenfunktion auch ein reduziertes Angst-ähnliches Verhalten7. Mäuse, denen der CRHR1 selektiv im Vorderhirn in Teilen des limbischen Systems fehlt, zeigen trotz einer normalen basalen HHN-Achsenfunktion eben-falls eine reduzierte Ängstlichkeit8.

Der CRHR1 ist auf verschiedenen Neuronentypen im Gehirn exprimiert

Der CRHR1 ist beim Menschen und in der Maus im gesamten Gehirn zu finden, allerdings war bislang weitgehend unbekannt, auf welchen Neuronen – im Hinblick auf die Neurotrans-mitteridentität – der CRHR1 vorkommt. Diese Wissenslücke ist in erster Linie auf das Fehlen eines geeigneten Antikörpers zur zuverlässigen Detektion des Rezeptors zurückzuführen. In Kontrollexperimenten mit Zelllinien, die eine definierte Menge des CRHR1 exprimieren und mit Mäusen, denen der Rezeptor vollständig fehlt, konnten wir zeigen, dass die derzeit ver-fügbaren Antikörper weder eine ausreichende Sensitivität noch eine entsprechende Spezi-fität besitzen, um den CRHR1 eindeutig auf Gewebeschnitten nachzuweisen6. Aus diesem Grund haben wir ein sensitives in situ-Hybridi-sierungsverfahren etabliert, das den parallelen Nachweis zweier verschiedener mRNA-Spezies erlaubt. Dies geschieht durch die gleichzeitige Verwendung einer radioaktiv markierten Sonde zum Nachweis des CRHR1 sowie verschiedener Digoxigenin-markierter Sonden, die den spezi-fischen Nachweis von Neuronen anhand ihrer Neurotransmitter-Ausstattung erlauben: Glu-tamat, γ-Aminobuttersäure (GABA), Dopamin und Serotonin. Darüber hinaus haben wir soge-nannte Reportermäuse etabliert, die anstelle des

Das Corticotropin-releasing Hormone: Das Neuropeptid Corticotropin-releasing Hor-mone (CRH) ist von zentraler Bedeutung für eine adäquate Anpassungsreaktion des Organismus auf einen Stressor. Im Zuge der Stressantwort koordiniert CRH sowohl die neuroendokrine Stressreaktion als auch Ver-haltensweisen, die für die Stressanpassung essentiell sind, was sich in seiner dualen Funk-tionalität widerspiegelt: Zum einen steht das CRH als hypothalamisches Releasing-Hormon an der Spitze der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HHN)-Achse1. Zum anderen

fungiert es außerhalb des Hypothalamus als Neuroregulator, der die Aktivität klassischer Neurotransmitter moduliert2. Auf diese Weise ist das CRH sowohl in die Kontrolle des autonomen Nervensystems als auch in Prozesse rund um Lernen, Gedächtnis, Auf-merksamkeit und Emotionalität involviert. Die biologische Aktivität des CRH wird primär über den CRH-Rezeptor Typ 1 (CRHR1) vermit-telt – einen G-Protein-gekoppelten Sieben-Helix-Transmembran rezeptor. Die Bedeutung des CRH-Systems ergibt sich auch aus klinischen Befunden, die dessen

Abb. 1: Schematischer Schnitt durch das Mausgehirn, der die Verteilung CRHR1-positiver Neu-ronen zeigt (rote Punkte). Die Neurotransmitteridentität CRHR1-exprimierender Neu-rone in ausgewählten Gehirnregionen ist durch die entsprechende Hintergrundfarbe angedeutet. Abkürzungen relevanter Hirnregionen sind der Tabelle 1 zu entnehmen.

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CRHR1 ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren. Mit Hilfe von spezifischen Antikör-pern gegen das GFP und gegen Marker für die verschiedenen Neuronenpopulationen konnten wir die Identität CRHR1-exprimierender Neuro-nen zusätzlich auf der Proteinebene nachweisen und die Ergebnisse der in-situ-mRNA-Analyse unabhängig bestätigen (Abb. 1, Tab. 1).

Die Neurotransmittertyp-spezifische Inaktivierung des CRHR1

Nun stellte sich die Frage nach der Funktion des CRHR1 auf diesen verschiedenen Neuronentypen, insbesondere im Hinblick auf die Modulation von Angstverhalten6. Klassische pharmakologische Methoden, wie zum Beispiel die Verwendung entsprechender Antagonisten, schieden hier aus, da sie auf alle CRH-Rezeptoren wirken würden, unabhängig von ihrer Lokalisation. Hier bietet die Mausgenetik mit dem sogenannten Cre/loxP-System entsprechende Möglichkeiten, die eine selektive Neurontentyp-abhängige Inak-tivierung des Rezeptors erlauben. Zu diesem Zweck wurden Mäuse, bei denen das CRHR1-Gen der Maus durch gentechnische Methoden mit sogenannten loxP-Erkennungssequenzen flankiert ist, mit transgenen Cre-Mauslinien gekreuzt. Sobald die Cre-Rekombinase zwei loxP-Erkennungssequenzen erkennt, schneidet sie die dazwischenliegende DNA heraus und deletiert somit das CRHR1-Gen, wodurch der Rezeptor inaktiviert wird. Durch die Verwen-dung spezifischer Cre-Mauslinien, die dieses Enzym nur in Neuronen produzieren, die den

Neurotransmitter Glutamat, GABA, Serotonin oder Dopamin verwenden, erfolgte die CRHR1-Inaktivierung Neurotransmittertyp-spezifisch. Das Muster der CRHR1-Inaktivierung in den je-weiligen Mauslinien stimmte vollständig mit der vorherigen histochemischen Charakterisierung überein und belegt die hohe räumliche Spezifität dieses Ansatzes (Tab. 1).

CRHR1 moduliert Angstverhalten bidirektional

Die resultierenden vier Neurotransmittertyp-spezifischen konditionalen CRHR1-Knockout-Mauslinien wurden umfassend hinsichtlich HHN-Achsenfunktion, Lokomotion, Stressbe-wältigungsverhalten, Furchtgedächtnis und Angstverhalten phänotypisiert. Tiere, denen der CRHR1 in GABA-produzierenden (GABAergen) oder in Serotonin synthetisierenden (serotoner-gen) Neuronen fehlt, zeigten keinerlei Verände-rungen des Angstverhaltens. Tiere, denen der CRHR1 in Glutamat-produzierenden (glutama-tergen) Neuronen des Vorderhirns fehlt (CRHR-1Glu), zeigten in den verschiedenen Angsttests durchgehend weniger ängstliches Verhalten im Vergleich zu Kontrollgeschwistertieren (Abb. 2). Überraschenderweise und im Gegensatz zu den CRHR1Glu-Mäusen, zeigten Mäuse, denen der CRHR1 in Dopamin-produzierenden (dopa-minergen) Neuronen des Mittelhirns (CRHR1DA) fehlt, in allen Tests eine erhöhte Ängstlichkeit (Abb. 2). Keine der vier Linien zeigte Verände-rungen in der basalen oder Stress-induzierten HHN-Achsenaktivität, so dass die Änderungen

im Angstverhalten unabhängig von der HHN-Achse und direkt auf den Verlust des CRHR1 in der jeweiligen Neurotransmitterpopulation zurückzuführen sind.

CRHR1 moduliert glutamaterge Neuro-transmission und Dopaminfreisetzung

Die Tatsache, dass Mäuse, denen der CRHR1 in glutamatergen Neuronen des Vorderhirns fehlt, eine reduzierte Ängstlichkeit zeigen, deutet auf eine Glutamat-abhängige Neurotransmission hin. Zudem fehlt CRHR1Glu-Mäusen der CRHR1 im Hippocampus und in der Amygdala, zwei Hirnregionen des limbischen Systems, die wichtig für die Ausprägung von emotionalem Verhalten sind. In der Tat zeigten elektrophysio-logische Messungen im basolateralen Anteil der Amygdala, dass der CRHR1 hier spezifisch auf glutamatergen Neuronen zu einer Verstärkung der Feldpotentiale nach CRH-Stimulation führt – ein Effekt, der in CRHR1Glu-Mäusen komplett verlorengeht. Im Hippocampus stellte sich die Situation ähnlich dar: Hier konnten wir mit Hilfe des sogenannten „Voltage-sensitive dye imaging“ auf der Netzwerkebene zeigen, dass der CRHR1 selektiv auf glutamatergen Neuronen die Aktivitätsausbreitung im hippokampalen Netzwerk beeinflusst.

Die Interaktion zwischen CRH/CRHR1-System und dopaminergem System wurde bislang fast ausschließlich hinsichtlich seiner Rolle im Suchtverhalten untersucht und weniger im Rahmen von emotionalem Verhalten9. Eines der Zielgebiete dopaminerger Neuronen des Mittelhirns ist der präfrontale Cortex. CRHR1DA-Mäuse, denen der CRHR1 spezifisch auf dopa-minergen Neuronen fehlt, zeigten im Vergleich zu Kontroll geschwistertieren eine geringere Freisetzung von Dopamin im präfrontalen Cortex nach Stress. Dieses Ergebnis zeigt, dass der CRHR1 die Dopaminfreisetzung im Rahmen der Stressreaktion kontrolliert. Diese CRHR1-positiven Dopamin-produzierenden Neuronen, die Angst-lösende Effekte vermitteln, definieren möglicherweise eine neue Subpopulation von dopaminergen Neuronen, die insbesondere für das Angstverhalten von Bedeutung sind.

Die beobachtete bidirektionale Kontrolle des Angstverhaltens durch den CRHR1 zeigt, dass das CRH über den CRHR1 unter physiologischen Bedingungen glutamaterge und dopaminerge Systeme kontrolliert. Die Tatsache, dass Mäuse, denen der CRHR1 im gesamten Gehirn fehlt (CRHR1ZNS) und die keinerlei Veränderungen im Angstverhalten zeigen (Abb. 2), deutet darauf hin, dass sich diese zwei antagonistischen CRHR1-Systeme im Falle einer kompletten Eliminierung gegenseitig aufheben.

Somit könnte eine Störung des Gleichge-wichts von CRHR1-kontrollierten glutamatergen und dopaminergen neuronalen Netzwerken ursächlich für die Entstehung psychischer Er-krankungen sein. Eine erste klinische Studie mit einem CRHR1-Antagonisten zeigte eine deutli-

Tab. 1: Zusammenfassung der CRHR1-Expression im Mausgehirn

Relative ExpressionsstärkeGrad der

Co-Lokalisation

Knockout-Mauslinie, die

eine CRHR1-Dele-tion zeigtHirnregion CRHR1 Neurotransmitter

Olfaktorischer bulbus (OB) ++++ Glu ++GABA ++++

++++ CRHR1GABA

Cortex (Cx) +++ Glu +++GABA ++

++++ CRHR1Glu

Hippocampus(CA1, CA2, CA3, DG) +++ Glu +++

GABA +++++/- CRHR1Glu

Retikulärer thalamischer Kern (RTN) +++ GABA ++++ ++++ CRHR1GABA

Mediales Septum (MS) +++ GABA ++++ +++ CRHR1GABA

Laterales Septum (LS) ++ GABA ++ ++ CRHR1GABA

Bettkern der Stria Terminalis (BNST) ++ GABA ++ ++ CRHR1GABA

Basolaterale Amygdala (BLA) +++ Glu ++ ++ CRHR1Glu

Mediale Amygdala (MA) ++ GABA ++ ++ CRHR1GABA

Globus pallidus (GP) ++++ GABA ++++ ++++ CRHR1GABA

Substantia nigra (SN) +++ DA ++++ ++++ CRHR1DA

Ventrales tegmentales Areal (VTA) +++ DA +++ +++ CRHR1DA

Raphe-Kerne (RN) + 5HT +++ + –




che Verbesserung von Depressions- und Angstsymptomen in Patienten10. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind ein wichtiger Hinweis darauf, dass eine Fehlregulation des CRH/CRHR1-Systems, wie sie in vielen depressiven Patienten zu beobachten ist, möglicherweise auf spezifische neuronale Netzwerke beschränkt ist. Zudem unterstreichen sie, dass ein therapeu-tischer Nutzen von CRHR1-Antagonisten nur bei solchen Patienten zu erwarten ist, deren CRH/CRHR1-System aus dem Gleichgewicht geraten ist, was vermutlich auch die jüngsten negativen klinischen Studien mit CRHR1-Antagonisten erklärt11. In Zukunft wird es entscheidend sein, aussagekräf-tige Biomarker, wie zum Beispiel Veränderungen der Schlafarchitektur, zu etablieren, um jene Patienten zu identifizieren, bei denen der Einsatz von CRHR1-Antagonisten sinnvoll ist12.

Literatur

[1] Vale W et al. (1981) Science 213: 1394.1397.[2] Gallagher JP et al. (2008) Eur J Pharmacol. 583 : 215-225.[3] Holsboer F (1999) J Psychiatr Res. 33: 181-214.[4] Lu A et al. (2008) Mol Psychiatry 13 : 1028-1042.[5] Kimura M et al. (2009) Mol Psychiatry 15 : 154-165.[6] Refojo D et al. (2011) Science 333: 1903-1907.[7] Timpl P et al. (1998) Nat Genet. 19: 162-166.[8] Müller MB et al. (2003) Nat Neurosci. 6: 1100-1107.[9] Sillaber I et al (2002) Science 296: 931-333.[10] Zobel AW et al. (2000) J Psychiatr Res. 34: 171-181.[11] Binneman B et al (2008) Am J Psychiatry 165: 617-620.[12] Holsboer und Ising (2010) Annu Rev Psychol. 61: 81-109.


Dr. Jan M. DeussingMax-Planck-Institut für PsychiatrieKraepelinstr. 2-1080804 MünchenTel.: +49-(0)[email protected]

Abb. 2: CRHR1Glu-Mäuse sind weniger ängstlich im Vergleich zu Ge-schwistertieren. Umgekehrt zeigen CRHR1DA-Mäuse in allen Tests eine erhöhte Ängstlichkeit. Mäuse, denen der CRHR1 im gesamten Gehirn fehlt (CRHR1ZNS) zeigen keine Veränderun-gen des Angstverhaltens. DaLi: Dark/Light box; EPM: Elevated plus maze; NOET: Novel object exploration test; Ctrl: Kontroll-geschwistertier; CKO: konditionaler Knockout.

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Abb. 1: Schritte vom FFPE-Schnitt bis hin zur aufgereinigten RNA

Blitzlicht Probenvorbereitung

RNA-Isolation aus FFPE-Gewebe: Säulchen- und Bead-basierte MethodenRobert Loewe, GeneWake GmbH, Neuried

Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettetes (FFPE) Gewebe ist aufgrund seiner diagnostischen Bedeutung und breiten Verfügbarkeit ein interessantes Probenmaterial. Die Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus FFPE-Gewebe ist jedoch – sofern diese quantitativ und qualitativ korrekt sein soll – nicht trivial. Anhand von zwei kommerziell verfügbaren Kits wird in diesem Beitrag eine mögliche Anwendung in der Routine aufgezeigt. Eine verwendete Tech-nik basiert auf Kieselgel-Matrix-Säulchen, die andere auf magnetischen Partikeln. Besonders im höheren Durchsatz ist generell die „Bead-Technologie“ gut geeignet. Mit einem neuen Protokoll zeigten sich bei beiden Methoden vollkommen vergleichbare Resultate. Um dies nachvollziehen zu können, wurden alternierende Schnitte des gleichen histologischen FFPE-Blocks parallel aufgereinigt und im Anschluss auf RNA-Menge, RNA-Qualität und Verhalten in einer qPCR nach reverser Transkription überprüft. Abhängig vom Ausgangsmaterial und dessen Menge ist die Nukleinsäureaufreinigung aus FFPE-Gewebe in der Routine möglich und somit in einen diagnostischen Ablauf integrierbar. Der Maßstab reicht von Einzelproben bis hin zum Massendurchsatz.

repräsentativ für den entsprechenden Tumor sein sollte.

In der traditionellen Pathologie wird zur Analyse in der Regel Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettetes (FFPE) Gewebe für Färbungen sowie Immunohistochemie verwendet. Diese Probenart gibt routinemäßig valide Ergebnis-se, ist jedoch kein einfaches Material für die Nukleinsäureaufreinigung. Die angefertigten Schnitte müssen über eine aufwendige Prozedur entparaffiniert und mittels enzymatischem Ver-dau soweit möglich von Formalin-induzierten Quervernetzungen zur Nukleinsäure selbst und zu Proteinen befreit werden, da diese die anschließende PCR inhibieren. Das stellt gewisse Anforderungen an die verwendete Chemie. Zum einen muss das Wachs entfernt werden, zum anderen die Lyse des Schnittes vollständig genug sein, um die Nukleinsäuren für die Isolierung freizusetzen.

Säulchen versus Beads

Trotz der technischen Hürden ist FFPE-Gewebe das wichtigste Ausgangsmaterial zur beglei-tenden Diagnose bei einer zielgerichteten Therapie. Zur Nukleinsäureaufreinigung werden dabei unterschiedliche Verfahren eingesetzt. Am häufigsten sind die sogenannten Säulchen-basierten und die Bead-basierten Aufreini-gungssysteme. Säulchen sind für ihre einfache Handhabung und für gute Ausbeuten bekannt3. Sie sind allerdings ungeeignet für den hohen Durchsatz und nur schwer automatisierbar. Mit steigendem Probenvolumen ist ihr Einsatz für die Routine nicht mehr geeignet. Bead-basierte Methoden erfüllen die beiden letzteren Kri-terien. Das Maxwell® 16 System von Promega nutzt ein Bead-basiertes Protokoll und ist für den mittleren Durchsatz und die Automation gut geeignet.

Die meisten Vergleiche von FFPE-Aufreini-gungsmethoden beschränken sich auf manuelle Verfahren4. Ziel dieser Studie war es daher, ein im Labor entwickeltes, automatisiertes Protokoll einem Säulchen-Protokoll gegenüberzustellen. Ein Vergleich der beiden Methoden sollte zeigen, ob diese in Ausbeute und Nukleinsäurequalität gleichwertig sind. Um auch Einzelproben mit hohen Probenzahlen vergleichbar zu machen, wurde das Bead-Protokoll auf geringe Mengen Einsatzmaterial angepasst. Dies ist notwendig, da unterschiedliche Ausbeuten von RNA einen direkten Vergleich der Rohwerte nicht erlauben. Erst nach einer Normalisierung über sogenannte Referenzgene wäre eine Gegenüberstellung der Werte möglich. Die Bindekapazität sowie die Lyseeffektivität der Bead-basierten Methode wurden an das Säulchenprotokoll angeglichen, was zu einer direkten Vergleichbarkeit führte. Dies wurde ermöglicht durch eine Veränderung

Zielgerichtete Therapien halten immer stärker Einzug in den klinischen Alltag. Dies ist beson-ders in der Onkologie der Fall. Beispiele sind spe-zifische Antikörper, die sich gegen Wachstums-faktoren, wie etwa EGFR (z.B. Cetuximab), oder deren Rezeptoren richten. Zielgerichtet wirken aber auch Tyrosinkinaseinhibitoren, zum Beispiel bei somatischen Mutationen des EGFR-Gens (z.B. Erlotinib) oder des BRAF-Gens (Vemurafenib) oder Medikamente zur Behandlung von Tumo-

ren mit einem Fusionsgen, wie etwa EML4-ALK (Crizotinib). Bei allen erwähnten Beispielen ist eine begleitende Diagnostik zwingend notwen-dig; dabei wird immer häufiger Real Time-PCR zur Erkennung von Tumormarkern eingesetzt1. Anders als Leukämien sind solide Tumoren jedoch schwieriger in der Probenbereitung, da eine einfache Blutabnahme nur bedingt aussa-gekräftig ist. Daher wird zur korrekten Diagnose Gewebematerial benötigt, welches möglichst www.laborwelt.de

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Blitzlicht Probenvorbereitung

des Lyse-Puffers, eine Anpassung des Proteinase K-Verdaus und einen Wechsel des Laufprotokolls auf dem Maxwell® 16-Gerät selbst. Wie schon öf-ter gezeigt wurde, kann ein optimierter Proteina-se K-Verdau die RNA-Ausbeute vergrößern1,2,5.

RNA-Aufreinigung

Da in der Regel im testenden Labor Genexpres-sionsanalysen durchgeführt werden, stand die Aufreinigung von RNA im Vordergrund. Um gleiches Ausgangsmaterial zu gewährleisten, wurden alternierende Schnitte desselben histologischen FFPE-Blocks für die Isolierung verwendet. Das Tumormaterial war Granulosa-zelltumor. Die Schnitte wurden in Duplikaten be-ziehungsweise Triplikaten isoliert. In Abbildung 1 sind die einzelnen Schritte bis zur aufgereinigten Nukleinsäure schematisch dargestellt.

Die gewonnene RNA wurde mit der MMLV- Punktmutante (Promega) umgeschrieben. Anschließend wurde die Genexpression mittels SYBR green-basierter qPCR auf dem LightCy-cler480 (Roche) überprüft. Für eine genauere Diagnostik wurden 23 Gene in ihrer Expression überprüft.

Zielsetzung hierbei war es, nur geringe Abwei-chungen in den Cq-Werten (jenseits 2 Cq bei den meisten Genen) und des globalen Mittelwertes zu erzielen. Hierfür wurde das Konfidenzintervall von 95% angestrebt (97,5% bis 99,3% wurden beim Einzelvergleich erreicht). Das Genexpres-sionsprofil sollte durch die unterschiedlichen Aufreinigungen nicht verzerrt werden, um eine Fehldiagnose möglichst unwahrscheinlich zu machen.

Ein Vergleich der Säulchen-Systeme (für das DNA ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System bzw. für RNA ReliaPrep™ FFPE Total RNA Mini-prep System, beide Promega) mit dem im Labor entwickelten Bead-Protokoll für das Maxwell® 16 Blood DNA Purification Kit zeigte keine für die Diagnostik relevanten Unterschiede der Protokolle (Tab. 1).

Beim Einsatz der drei verschiedenen Aufreinigungsprotokolle traten keine Unter-schiede in den Cq-Werten beziehungsweise der Expressionsstärke auf, die relevant für die Therapieentscheidung sind. Dies zeigt sich beispielsweise bei der Analyse der ERBB2-Expression, welche unabhängig vom eingesetzten Aufreinigungssystem vergleich-bare Expressionslevel liefert (ERBB2 ist ein Marker, der über die Trastuzumab-Therapie entscheidet). Die Qualität und Ausbeute der aufgereinigten RNA ist also für alle drei Pro-tokolle gleichwertig.

Protokolloptimierung für genomische DNA

Das verwendete Protokoll bei der Bead-Aufrei-nigung wurde von uns für die RNA-Isolierung optimiert. Dies wird beim Cq-Vergleich der

genomischen DNA deutlich. Hierfür wurden die gleichen Proben an drei Genabschnitten mit Primern unterschiedlicher Effizienz – und Anfälligkeit für Inhibitoren – mit SYBR green gemessen.

Der vom Hersteller für genomische DNA ent-wickelte Kit zeigt deutlich bessere Ergebnisse als der Total RNA Kit für Säulchen und der auf RNA optimierte, Bead-basierte Kit. Durch Modifika-tion des Maxwell® 16-Protokolls auf optimale RNA- und DNA-Ausbeuten konnte der Cq-Wert um drei verringert werden. Dazu wurde der Bindepuffer gegen 70%-iges Isopropanol ausge-tauscht und die Proteinase K-Verdauzeit von 30 Minuten auf bis zu sechs Stunden verlängert.

In Tabelle 3 wird die Verbesserung der Cq-Werte allein aufgrund der Verlängerung der Proteinase K-Inkubationszeit gezeigt. Ausgangs-material war hierbei Kolonkarzinom in sehr schlechter Qualität. Das Optimum der Verdau-zeit lag zwischen zwei und vier Stunden, da nach vier Stunden die RNA-Ausbeute deutlich abfiel. In der optimierten Form ist damit das Bead-basierte Protokoll mit dem Säulchen-basierten komplett vergleichbar.

Fazit: Verschiedene Methoden – vergleichbare Ergebnisse

Versuchsreihen mit unterschiedlichem Durch-satz und Methoden verschiedener Labore kön-nen mit den eingesetzten Produkten problemlos gemeinsam ausgewertet werden. Zusätzlich sind sowohl Säulchen- als auch Bead-basierte Protokolle eine valide Möglichkeit um RNA und DNA gleichermaßen und von der gleichen Probe zu analysieren. Eine Entscheidung vorab – ob nun RNA oder DNA isoliert werden sollte – und der Verlust von wertvollem Probenmaterial kann somit vermieden werden.

Literatur

[1] Paik, S. Tang, G., Shak, S., Kim, C., Baker, J., Kim, W., Cronin, M., Baehner, F.L., Watson, D., Bryant, J., Costantino, J.P., Geyer, C.E. Jr, Wickerham, D.L., Wolmark, N.,J Clin Oncol 10 (2006), 3726-3734.

[2] Chung, J.Y., Braunschweig, T., Hewitt, S.M., Diagn Mol Pathol 15 (2006), 229-236.

[3] Bonin, S., Hlubek, F., Benhattar, J., Denkert, C., Dietel, M., Fernandez, P.L., Höfler, G., Kothmaier, H., Kruslin, B., Mazzanti, C.M., Perren, A., Popper, H., Scarpa, A., Soares, P., Stanta, G., Groenen, P.J., Virchows Arch 457 (2010), 309-317.

[4] Ribeiro-Silva, A., Zhang, H., Jeffrey, S.S., BMC Mol Biol 21 (2007), 118-128.

[5] Abramovitz, M., Ordanic-Kodani, M., Wang, Y., Li, Z., Catzavelos, C., Bouzyk, M., Sledge, G.W. Jr, Moreno, C.S., Leyland-Jones, B., Biotechniques 44 (2008), 417-423.


Robert LoeweGeneWake GmbHFloriansbogen 2–482061 [email protected]

Relia-c Relia-g Max-c

18S 9,78 10,07 8,70

ACTG2 26,88 24,65 25,64

ANXA2 22,20 22,18 22,90

ATM 23,13 22,58 24,07

EGFR 28,73 28,40 28,06

ERBB2 26,22 25,65 24,89

ERCC1 26,50 26,24 26,90

FANCF 21,92 21,29 20,50

FOXM1 24,76 24,91 23,78

HMBS 26,02 25,97 22,38

MTOR 27,61 27,77 23,65

NFKB1 24,83 24,66 25,87

NFKB2 23,96 23,07 24,71

POLR2B 26,78 26,87 25,16

PTGS2 22,68 22,34 24,61

RAD50 26,97 26,59 24,69

RPL32 18,55 19,38 17,49

TOP2A 23,76 24,21 25,02

TYMP 30,59 29,29 30,76

TYMS 26,42 26,59 27,59

VEGFA 22,85 22,46 23,77

VIM 25,15 27,43 23,55

XRCC5 25,39 25,50 22,43

XRCC6 20,90 20,40 20,94

Tab. 1: Cq-Vergleich (Genexpression) der unterschiedlichen Kits. Proben wurden jeweils dreifach angesetzt. (Relia-g= ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep-System ohne RNase; Relia-c = RNA ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep-System; Max-c = auf RNA optimiertes Maxwell® 16 Blood Purification Kit)

Relia-g Relia-c Max-c

KRAS 24,95 27,31 27,81

BRAF 25,56 28,07 28,71

EGFR 25,60 29,87 28,78

Tab. 2: Cq-Vergleich (DNA-Gehalt und Amp-lifizierbarkeit) der unterschiedlichen Kits. Proben wurden jeweils dreifach angesetzt.

0,5h 2h 4h 6h

KRAS 32,36 31,20 30,53 30,65

BRAF 37,03 35,94 35,015 34,58

EGFR 36,20 35,22 32,28 32,97

Tab. 3: Effizienz der Maxwell®16 gDNA-Isolierung aus FFPE-Material in Ab-hängigkeit der Proteinase K-Inkubati-onsdauer. Ausgangsmaterial: geringe Menge an Kolonkarzinom

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Report Karrierewelt

Dynamik des Arbeitsmarktes fördert freies Spiel der KräfteDieter Lingelbach, Managing Partner, Life Science Consult, München

Die Arbeitsmärkte öffnen sich dem internationalen Publikum. Die Life Sciences mit ihrem Bedarf an Spezialisten sind einer der Vorreiter. Das verändert die bisherigen Wettbewerbsbedingungen in hohem Tempo. Genauso wie sich Technologien und deren Anbieter laufend neu erfinden müssen, so gilt das auch in erheblichem Maß für die Ressource Arbeitskraft. Wer ist am ehesten herausge-fordert und zu Anpassungen gezwungen?

Beispiel im deutschsprachigen Raum bleibt es immer noch eine legitime und auch politisch akzeptable Frage, ob man auch (fremdsprachi-ge) Ausländer auf dem jeweiligen leeren oder neuen Posten sieht. Je nach Einzelfall wird eine analoge Frage auch zu indischstämmigen Kol-legen angesprochen.

Warum sind solch diskriminierende Fragen angemessen und fair? Objektiv eine Hürde sind die meist von den Unternehmen zu zahlenden Umzugskosten und die normalen sprachlichen Hürden bei der Integration im Tagesablauf. Eine sehr viel kritischere, obgleich softe Hürde, ist die mittelfristige Integration in die Unter-nehmenskultur. Wie ist das Verständnis von Teamplay, wie wird kritisiert, wie vorgetragen, wir- oder ichbezogen? Was ist das Verständnis von „Kontrolle“ und „Führung“? Wie detailliert ist eine „Strategie“ und die daraus resultieren-den Vorgaben an die Kollegen?

Hier unterscheiden sich die Kulturkreise deutlich, was im Regelfall zu Reibungsverlusten führt. Zwischen den Länderorganisationen weltumspannender Konzerne ist das Phäno-men bekannt und normal – nur: Soll man sich diese Reibungsverluste innerhalb der meist kleineren und weniger etablierten Unterneh-mensorganisationen der Life Sciences auch noch leisten? Insofern haben deutsche (bzw. heimische) Kandidaten meist immer noch den Vorteil, daß man sie für ‚berechenbarer‘ hält.

Fachlich-theoretische Kompetenz, Aus-landsaufenthalte und gute Noten allein reichen nicht mehr aus; zunehmend werden in Vorstellungsgesprächen ‚soft skills‘ ab-gefragt. „Wichtige Karrierevoraussetzung ist die Fähigkeit, Menschen aus Japan, Indien, USA oder Frankreich gleichermaßen wirkungs-voll führen zu können oder für einen Chef aus einem dieser Länder arbeiten zu können“, sagt Dr. Manfred Baier, bei Roche Diagnostics lange Jahre für die Zusammenarbeit mit Hitachi zuständig2. Nicht glücklich operiert dann der Kandidat, der sich vom Seminar zu Personal-management Führungs„tricks“ erwartet, so wie es der Dozent wiederholt erfährt. Oder dem Themen wie „soziale Kompetenz“ und „emotionale Intelligenz“ völlige Fremdwörter sind. „Gerade hier müssen die im europäischen Arbeitsmarkt traditionell hofierten Männer noch viel dazu lernen“3.

Literatur

[1] Geschäftserfolg in Indien, Springer-Verlag, 2011[2] Dr. Manfred Baier, Leiter Roche Applied Science innerhalb

Roche Diagnostics[3] Hubert Friedmann, langjähriger Leiter Personal in Penzberg

und Coach in Personalführung


Dieter LingelbachLife Science Consult [email protected]

Auf Stellenauschreibungen der Life Science-Branche in Deutschland melden sich zu-nehmend Kandidaten aus Indien mit teils internationaler Arbeitserfahrung. Auf den Anforderungsblättern für neue Mitarbeiter in Deutschland heißt es zunehmend, „German language skills a nice to have“.

Was haben diese Beobachtungen gemein-sam? Sie beschreiben veränderte Wettbe-werbsfähigeiten und Gegebenheiten auf dem internationalen und gerade auch auf dem deutschen Arbeitsmarkt.

Auf Ausschreibungen für hochanspruchs-volle Stellen in der deutschen Life Sciences- Industrie melden sich auffällig viele Bewerber ausländischer Herkunft. Jüngst waren für eine Stelle in der Proteinfermentation im ersten Durchgang mehr indien- als deutsch-stämmige Kandidaten interessiert und geeig-net (Abb. 1). Russischstämmige Kandidaten machten bereits mehr als ein Zehntel aus. Diese Kandidaten haben durchweg bereits Berufserfahrung im Westen oder mit westli-chen Unternehmen in ihrem Heimatland. Ca-

rina Friedmann, ausgewiesene Indien-Expertin in Nürnberg1, beschreibt die Qualifikationen und das Interesse indischer Kandidaten so: „Insbesondere die sieben staatlichen, sehr kompetitiven Indian Institutes of Technology (IITs) und das Indian Institute of Science (IISc) in Bangalore haben ein international vergleichba-res hohes Niveau im Bereich Naturwissenschaf-ten. Für junge Absolventen dieser universitären Einrichtungen stellen Arbeitsmöglichkeiten im Ausland eine überaus interessante fachliche, persönliche und finanzielle Entwicklungsmög-lichkeit dar.“

Was bedeuten diese Veränderungen für Studenten europäischer Herkunft?! Sie werden zunehmend im internationalen Kontext gemes-sen, allemal ihre fachlichen Qualifikationen und ihre sogenannten ‚Achievements‘. Hier wird es zunehmend schwierig, sich allein auf Ausbil-dungen und Post-Doc-Erfahrungen in technisch weit vorangeschrittenen Ländern zu verlassen. Die Lösung für europäische Studenten und Kandidaten liegt zunehmend in den ‚soften‘ Faktoren: bei der Besetzung von Positionen zum

Abb. 1: Herkunft Kandidaten, Bsp.: Proteinfermentation

40_LW5_11_Lingelbach_tg.indd 40 19.10.2011 10:01:20 Uhr


Service Stellenmarkt

Akademischer Stellenmarkt Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt (auch online), der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu Ihre Anzeige (Ausschreibungstext als Word-Datei, Logo – jpg oder tiff, 300 dpi Auflösung) an [email protected]. Annahmeschluss für die nächste LABorWeLt-Ausgabe „Systembiologie, syn-thetische Biologie“ (erscheinungstermin 24.11.2011) ist der 11. November 2011.

Alle Stellenanzeigen finden Sie auch unter:

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International Ph.D. Programs in the Life Sciences

Description: The Life Science Zurich Graduate School consists of several highly competitive Ph.D. programs, run jointly by the ETH Zurich and the University of Zurich. Each program offers research and education opportunities in a stimulating international environment for ambitious students who wish to work towards a Ph.D. degree. Accepted students perform their research project in one of the participating research groups of their favorite program, according to their scientific interest. Advanced teaching and training courses are offered throughout the curriculum. The program language is English throughout. Ph.D. studies usually last 3-4 years.

Education: Applicants must hold or anticipate receiving a Master’s degree or equivalent from a university in a relevant field before starting the Ph.D. program. Applicants accepted for the program will have to register with either the University of Zurich or ETH Zurich, depending on the affiliation of their future research group.

Application: Our web pages provide detailed information for submission of ap-plication. Please refer to the guidelines as we only take into consideration appli-cations received in the required format: http://www.lifescience-graduateschool.ch/index.php?id=108 – Application deadlines are December 1 and July 1

Contact details: Dr. Susanna BachmannLife Science Zurich Graduate SchoolUniversity of ZurichInstitute of Molecular Life SciencesWinterthurerstrasse 190 · 8057 Zuriche-mail: [email protected]://www.lifescience-graduateschool.ch/

Die Translationale Onkologie an der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz (TRON) ist ein innovatives, schnell wach-sendes, biopharmazeutisches Institut mit dem Ziel, innovative Diagnostika und Arzneimittel zur Behandlung von Krebs und Erkrankungen des Immun-systems zu entwickeln. TRON arbeitet in intensiver Kooperation mit der Universität Mainz, der Universitätsmedizin Mainz sowie nationalen und internationalen Unternehmen und Instituten zusammen.

Zur Verstärkung unserer Funktionseinheit „Stemcells“ suchen wir zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine/n

technische/n Assistentin/en (BTA/MTA)

Die Funktionseinheit „Stemcells“ beschäftigt sich mit der Reprogram-mierung somatischer Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen). Die iPS-Zell Technologie ist für zukünftige Zelltherapien hoch relevant und wird derzeit intensiv beforscht. Innerhalb unserer Funktions-einheit sind Sie direkt an der Entwicklung unserer eigenen Methoden zur iPS-Zell Generierung beteiligt. Sie können proaktiv persönliche Akzente setzen und bekommen Einblicke in die vielschichtigen Fragestellungen der Stammzellbiologie. Nach entsprechender Einarbeitung übernehmen Sie die Planung und Durchführung von eigenen Experimenten, die sie in Absprache mit Ihren Teamkollegen durchführen. Hierbei helfen Ihnen Ihre strukturierte und zuverlässige Arbeitsweise und Ihre Freude an wissen-schaftlichen Experimenten.

Sie erwartet bei uns ein angenehmes Betriebsklima, gründliche Ein-arbeitung und herausfordernde Aufgaben im Bereich Forschung und Entwicklung von Krebstherapeutika, sowie ein abwechslungsreiches und spannendes Arbeitsumfeld. Wir suchen hoch motivierte Mitarbeiter, welche unsere Begeisterung für Forschung und Wissenschaft teilen, Spaß an der Bewältigung neuer Aufgaben haben und Teil unseres engagierten Teams werden wollen.

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Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmen-tal Health“ (Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die Forscherinnen und Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensationsfähigkeit des Organismus.

Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren e.V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands.

Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderprei-ses sowie des Total E-Quality Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt.

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Mediziner/in / Veterinär/in / Naturwissenschaftler/in für

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– Betreuung des kardio-vaskulären Screens der German Mouse Clinic– Auswertung sowie wissenschaftliche Evaluierung der erhobenen Daten– Betreuung eigener Forschungsprojekte – logistische Organisation des Untersuchungsablaufes– Entwicklung und Etablierung neuer Untersuchungsmethoden

(z.B. Echokardiographie, EKG)

Ihre Qualifikationen

– Hochschulabschluss mit Promotion– wissenschaftliche Forschungstätigkeit mit Mausmodellen ist

wünschenswert– Berufserfahrung im Bereich Ultraschall-Untersuchungen und– Vorkenntnisse in der Auswertung von EKG-Daten sind wünschenswert – ausgeprägte Teamfähigkeit– sehr gutes Englisch

Unser Angebot

– Tätigkeit in einem innovativen, zukunftsorientierten Unternehmen– umfangreiches Fortbildungsangebot– zunächst für zwei Jahre befristetes Arbeitsverhältnis und eine Vergütung

nach TVöD (EG 13)

Bitte senden Sie Ihre Bewerbung bevorzugt per E-Mail an:Nadine FischerE-Mail: [email protected]: +49-(0)89 3187-4335

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH)Institut für Experimentelle GentechnikIngolstädter Landstraße 185764 Neuherberg

The IPK is a large, internationally recognized centre of plant research that addresses problems of modern biology with an emphasis on crop plants. Our laboratories host an international workforce that brings together a diversity of qualifications and scientific backgrounds. Current research aims for the development of genetic and biotechnological tools and the comprehensive use of plant-genetic resources to optimise crop traits in sustainable agricultural plant production. For this purpose, the IPK cooperates with many national and international universities and research institutions and enterprises.

For the working group of Gene and Genome Mapping we are looking for a

PostDoc (m/f) (100% up to E13 TV-L)

Employment starts at earliest date possible for a period of circa three years.

The position will be part of a project in the frame of the German research pro-gramme ‘Pflanzenbiotechnologie der Zukunft’ and is funded by BMBF.

General project information: Association mapping has emerged as novel technique for exploiting a broad range of genetic diversity and to identify markers or genes associated to pheno-typic traits. In the current project a collection of recent European wheat cultivars will be covered with SNP-markers and investigated in field trials for agronomic performance, resistance to diseases and drought resistance. Furthermore a number of mapping populations will be developed in order to validate previously identified marker-trait associations. The project takes place in collaboration with several industrial partners and other research institutes.

Your duties:The incumbent will be responsible to coordinate the scientific project part of IPK. The tasks involve the development of validation populations, the statistical interpretation of genotypic and phenotypic data, the writing of project reports and publications and the coordination with the other project partners.

You fit to us:Applicants should hold a PhD degree in biology or agronomy. Experiences in the application of molecular markers and the ability to handle large data sets are prerequisites for the position. Furthermore knowledge about statistical methods used in association genetics and experiences in handling appropriate software packages are an advantage and will serve as selection criteria. Special emphasis will be given to the ability to author scientific publications.

If you need further information feel free to contact Dr. Marion Röder. You reach her under [email protected] or phone +49 (0) 39482 5210.

Equal opportunities exist for female and male applicants. Hence, certified women are particularly asked to apply. A family-friendly environment is given. Severely disabled people are taken in preference when the same level of qualification is given.

Send your complete and informative application please up to 11th November 2011 under information of the identity figure 21/10/11 to Ms. Gläser ([email protected]). If you have questions to the application procedure and selection procedure you reach Ms. Gläser under phone +49 (0) 39482 5101.

Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK)Frau GläserCorrensstraße 306466 GaterslebenGermanywww.ipk-gatersleben.de

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Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmental Health“ (Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die For-scherinnen und Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensations-fähigkeit des Organismus.

Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren e.V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands.

Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderpreises sowie des Total E-Quality Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehin-derte werden bei gleicher Eignung bevorzugt.

Im internationalen Forschungsverbund des ‚Helmholtz Virtual Institute of Complex Molecular Systems in Environmental Health‘ (HICE) werden Effekte anthropogener Aerosole auf verschiedenen biologischen Ebenen mit modernsten analytischen Techniken untersucht, um detailliertere Aussagen über molekulare Wirkmechanismen zu erhalten. Im Rahmen dieses interdisziplinären Forschungsvorhabens sucht die Kooperationsgruppe ‚Comprehensive Molecular Analytics‘ (CMA) zum 01. Januar 2012 eine/n

Doktorand/in – Untersuchung von Aerosolen und deren Einfluss auf

biologische Systeme mit chemischen und physikalischen Methoden 2011/1213

Ihre Aufgaben

– Entwicklung von innovativen chromatographischen und massenspektrometri-schen Methoden zur Untersuchung von Aerosolen und biologischen Matrices

– Probenvorbereitung von Aerosolproben (Modellaerosol) und biologischem Probenmaterial (Zellen und Gewebe)

– Durchführung und Planung von Messungen mit modernen chromatographi-schen und massenspektrometrischen Methoden

– statistische Auswertung von Messdaten

Ihre Qualifikationen

– exzellenter und zeitnaher Hochschulabschluss (Diplom, Master) in Chemie mit dem Schwerpunkt analytische Chemie oder Abschluss eines vergleichbaren Studiums, das eine Promotion an einer deutschen Universität erlaubt

– praktische Erfahrungen im Umgang mit chromatographischen und massen-spektrometrischen analytischen Methoden

– großes Interesse an analytischen Arbeiten

– ausgeprägte Teamfähigkeit

Unser Angebot

– Tätigkeit in einem innovativen, zukunftsorientierten Unternehmen

– zunächst bis 31.12.2014 befristetes Arbeitsverhältnis und eine Vergütung nach TVöD (EG 13 50 %)

Bitte senden Sie Ihre Bewerbung bevorzugt per E-Mail an:Dr. Jürgen Schnelle-KreisE-Mail: [email protected]: +49-(0)89 3187-4605

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH)MassenspektrometriezentrumIngolstädter Landstraße 185764 Neuherberg

Global Head Drug Safety &Pharmacovigilance (m/f)

Company InformationOur client is an international Biotech Company with locations in Europe and the US.

Position• Responsible for all aspects of Drug Safety• Create and deliver the company´s Drug Safety and Pharmacovigilance strategy

• Build organizational depth and competence• Partner with senior leaders to define and implement solutions to any

issues• Monitoring of implementation and enhancement of SOPs • Supervision of the generation of periodic safety update reports • Analysis of safety data, Benefit-Risk assessment and Signal detection for the company products.

• Chairing the Company Safety Committee• Collaboration in national and international teams and project groups• Act as QPPV and Graduated Plan Officer

Candidate Profile• Medical doctor, with a focus on hematology• 8-12 years as QPPV and GPO in an international environment• Excellent communication skills, integrative thinking, assertive, results

oriented

MediatumExcellence is our standard. Specialization in life sciences is our strength. Mediatum is the premier recruiting boutique for innovative and successful companies in the biotech, pharmaceutical, medical devices and diagnostics industry.

If you are interested in this position please email your CV to Ms Freise: [email protected]

Mediatum Deutschland GmbHBergheimer Straße 89/1 | D-69115 Heidelberg | Germanywww.mediatum.com

The Leipzig School of Human Origins– An International Max Planck Research School –

by The University of Leipzig andThe Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology

The Leipzig School of Human Origins offers a unique interdisciplinary graduate program to study the evolutionary history of humans and great apes. Graduate

students are accepted into one of the following areas, but are encouraged to take part in courses and seminars from all three disciplines:

Comparative and Molecular Primatology

Evolutionary and Functional Genomics, Ancient DNA, Molecular Anthropology and Genome Bioinformatics

Human Paleontology, Prehistoric Archaeology and Archaeological Science

The language of the school is English. Visit www.leipzig.de for information on living in Leipzig, Germany, in the center of Europe. For project and application

details go to www.leipzig-school.eva.mpg.de or contact us at:e-mail: [email protected]

phone: +49(0)-341-3550-0 | fax: +49(0)-341-3550-119

Application deadline: January 31, 2012

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Service Verbände Seite bitte abtrennen – per Fax an 030-264921-11

Dt. Ver. Gesell. f. Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL)

Geschäftsstelle der DGKLFriesdorfer Str. 15353175 BonnTel.: +49-(0)-228-92-68-9522Fax: +49-(0)[email protected]

Deutsche Gesellschaft für Proteomforschung

c/o MPI für BiochemieAm Klopferspitz 18a82152 MartinsriedTel.: +49-(0)-89-1897-9007Fax: +49-(0)[email protected]

BIO Deutschland

Tegeler Weg 33/berlinbiotechpark10589 BerlinTel.: +49-(0)-30-3450593-30 Fax: +49-(0)-30-3450593-59 [email protected]

Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM)

c/o Institut für Hygiene und Med. MikrobiologieCarl-Neuberg-Straße 130625 HannoverTel.: +49-(0)-511-532-4655Fax: +49-(0)-511-532-4355www.dghm.org

bts (Biotechnologische Studenteninitiative e.V.)

c/o BIOCOMLützowstraße 33–3610785 BerlinTel.: +49-(0)-30-2649-21-21Fax: +49-(0)-30-2649-21-11www.btsev.de

Gesellschaft für Genetik

c/o HZM – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit/Inst. of Develop-mental GeneticsTel.: +49-(0)-89-3187-2610Fax: +49-(0)-89-4620www.gfgenetik.de

Gesellschaft für Signaltransduktion

c/o Prof. Dr. Ralf HassMed. Hochschule HannoverAG Biochemie u. Tumorbiol.30625 HannoverTel.: +49-(0)-511-532-6070Fax: +49-(0)-511-532-6071www.sigtrans.de

Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie

Geschäftsstelle der DGPTAchenbachstraße 4340237 DüsseldorfTel.: +49-(0)-211-600-692-77Fax: +49-(0)[email protected]online.de

Nationales Genomforschungsnetz

c/o DKFZIm Neuenheimer Feld 58069120 HeidelbergTel.: +49-(0)-6221-424-743Fax: +49-(0)[email protected]

Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik

Institut für Humangenetik Calwer Straße 772076 TübingenTel.: +49-(0)-7071-2977692Fax: +49-(0)-7071-295171peter.bauer@ med.uni-tuebingen.dewww.hihtuebingen.de/dgng/

Netzwerk Nutrigenomik

Netzwerk NutrigenomikArthur-Scheunert-Allee 11414558 NuthetalTel.: +49-(0)-33200-88-301Fax: +49-(0)[email protected]

DiagnostikNetBB

Netzwerk DiagnostikBerlin-Brandenburg e.V.Neundorfstraße 1716761 HenningsdorfTel.: +49-(0)-3302-55-199-14Fax: +49-(0)[email protected]bb.de

Verband der DiagnosticaIndustrie e.V.

Verband der Diagnostica-Industrie e.V.Neustädtische Kirchstr. 810117 BerlinTel.: +49-(0)-30-200-599-40 Fax: +49-(0)[email protected]

Österreichische Reinraumgesellschaft (ÖRRG)

ÖRRGNeudorf 41A-8262 Ilz Tel.: +43-(0)-3385-8117 Fax: +43-(0)[email protected] www.oerrg.at

Österreichische Ges. f. Laboratoriums medizin & Klinische Chemie

ÖGLMKC GeschäftsstelleInfomedica-KEG, Xenius BehalTullnertalgasse 72A-1230 WienTel./Fax: +43-(0)-1889-6238 [email protected]

www.oeglmkc.at

Kontakt zu Verbänden Die Mitglieder der nachfolgenden Fachgesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für eine Mitarbeit oder einen Beitritt interessiert, erreicht die Fachgesellschaften unter den folgenden Kontakt daten:

Ichinteressieremichfür denBeitritt UnterstützungfürJungwissenschaftler Interessenvertretung eineSpende FachgruppenimBereich

Verband(sieheunten,bitteankreuzen)

BittekontaktierenSiemich

Name Firma

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Service Produktwelt

Die Familie der Platten mit 96 flachbödigen Wells wird aus qualitativ hochwertigem Polystyren gefertigt – die optimalen Mikrotestplatten für Messungen der Fluoreszenz, Lumineszenz und Szintillation. Weiße Well-Platten erbringen maximale Reflektivität und optimieren hoch-empfindliche lichtemittierende Lumineszenz-Assays. Schwarze Mikrotestplatten machen den vollkommen absorbierenden Hintergrund ver-fügbar, der zum Minimieren der sonst hierdurch bedingten Interferenz und zum Ausschalten des Crosstalks zwischen Wells benötigt wird, damit fluorimetische Tests allerhöchster Leistung mög-lich werden. Mit Gewebekulturen präparierte Mikrotestplatten mit 96 Kavitäten stehen für Testreihen zum Zellwachstum bereit. Wegen der identischen Abmessungen zu standardmä-ßigen Testplatten im 96-Well-Format sind alle Porvair-Platten dieser Kapazität mit fast allen Lesegeräten, Robotorsystemen zur Probenauf-bereitung und Flüssigkeitshandhabung zu 100% kompatibel. Ein vollständiges Sortiment von Mi-krotestplatten mit 384 Kavitäten vervollständigt das Angebot von Porvair Sciences.

Vertrieb:Dunn Labortechnik GmbH Thelenberg 6 53567 Asbach Tel.: +49 (0)26 834 3094 [email protected]

Nachweisverfahren in der Humangenetik eingesetzt.

Getreu dem Firmennamen Carpegen, zu deutsch etwa: „Nutze das Gen“, konzentriert sich das Unternehmen auf moderne Genana-lyse-Verfahren, insbesondere Real-Time-PCR-Verfahren und innovative Diagnostik-Tests für die Arztpraxis. Die Entwicklungsarbeiten wer-den unter anderem vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert.

Der im Jahr 2003 erstmals vorgestellte Test Carpegen Perio Diagnostik ermöglicht es, Art und Anzahl Parodontitis-auslösender Bakte-rien in der Mundhöhle exakt zu bestimmen. Mit diesem Wissen können Zahnfleischent-zündungen zielgerichtet behandelt werden. Zahlreichen Zahnärzten gilt der Test seither als Referenzmethode. Auch wissenschaftli-che Untersuchungen belegen regelmäßig die qualitative Marktführerschaft des Verfahrens – zuletzt eine Vergleichsstudie, die an der Stein-beis-Hochschule Berlin in Zusammenarbeit mit der Deutschen Gesellschaft für Parodontologie durchgeführt wurde. Aktuell arbeitet das Carpegen-Team daran, das weiterzuentwickeln: Künftig soll der Zahnarzt die Testergebnisse erhalten, noch während der Patient auf dem Behandlungsstuhl sitzt. So kann er sofort mit einer gezielten Therapie beginnen.

Carpegen GmbH Yvonne Schoepe Tel.: +49 (0)251 - 980 2320 [email protected] www.carpegen.de

Im September 2011 feierte die Carpegen GmbH aus Münster zehnjähriges Bestehen. Das Unternehmen hat sich bei Zahnärzten und Ärzten einen Namen als Spezialist für molekulardiagnostische Verfahren erwor-ben. Viele Zahnarztpraxen beispielsweise nutzen regelmäßig das Testsystem Carpegen Perio Diagnostik, um für ihre Patienten die jeweils beste Therapie gegen Parodontitis zu finden. Andere Carpegen-Testsysteme dienen der Charakterisierung von Bakte-rien- und Pilzstämmen oder werden als

Die Biometra GmbH, ein Unternehmen des Analytik Jena-Konzerns, baut ihr Produktport-folio aus. Der TProfessional Basic XL Thermo-cycler ist das neueste Modell der Biometra TProfessional Thermocycler-Produktlinie und mit einem anodisierten 96 Well XL-Block für extra große Volumina bis zu 100 µl ausgestat-tet. Besonders für neue PCR-Techniken, wie zum Besipiel die Emulsions-PCR im Rahmen des Next Generation Sequencing oder für die Bisulfitbehandlung von DNA für Methylie-rungsstudien, sind oftmals große Reaktionsvo-lumina notwendig. Der TProfessional Basic XL Thermocycler bietet den Komfort, die Reaktion in einem einzigen Gefäß zu inkubieren, ohne Kompromisse bei der Temperaturuniformität oder den Heiz- und Kühlraten eingehen zu müssen. Der Thermocycler ist wahlweise mit oder ohne Gradientenfunktion zur Optimie-rung von PCR-Protokollen erhältlich.

Biometra GmbHDana SchmidtTel.: +49-(0)3641-779-281, Fax: +49-(0)36 41-779-988 [email protected]

Biometra

Thermocycler für Next Generation Sequencing

Carpegen

Molekulardiagnostik für Ärzte

Porvair

MikrotiterplattenPorvair Sciences offeriert ein umfassendes Sortiment an Mikrotestplatten im 96 Well-Format für routinemäßige Anwendungen zur Adsorption, Absorption, Vermischung und Lagerung. Hergestellt aus durchsichtigem Polystyren oder opakem Polypropylen stellt das 96-Well-Plattensortiment von Porvair eine kon-kurrenzlose Kombination aus Wirtschaftlichkeit und hohem Qualitätsniveau bereit. Es kann zwischen drei Well-Ausführungen (flach, rund und V-förmiger Boden) sowie Plattenformaten in Weiß, Schwarz und Schwarz-Weiß-Kombination gewählt werden. Folglich steht für faktisch jede Testanwendung eine optimierte Platte im 96-Well-Format bereit.

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Service Produktwelt

Gewo-Feinmechanik

Einfache Reinigung von Glaspipetten

So wie der Besteckkorb eines Geschirrspülers beliebig bestückt werden kann, so kann auch der Pipettenkorb des Glas-Pipetten-Reinigers beliebig für kurze, lange, dünne und dicke Pipet-ten eingesetzt werden. Je nach Modell werden die Pipetten in bis zu neun Körben (Köcher) gesammelt und darin gereinigt, gespült und getrocknet. Der Sieblochboden im Korb gestat-tet die freie Platzierung der Pipetten bei jedem Durchmesser bzw. ab 0,1 ml und bis zu einer Länge von 600 mm ohne eine vorgegebene Positionierung. Jeder Korb lässt sich mit einer Identifikationsmarke versehen, um bei Bedarf individualisiert eingesetzt zu werden. Der Korb

wird am Griff von Hand senkrecht von oben bequem in den Pipetten-Reinigungsautomaten gestellt und nach dem Trocknen auf gleiche Weise entnommen.

Die Pipettenwäsche selbst erfolgt glasscho-nend als Bad und nicht über Injektor-Düsen oder mittels einer Sprühdusche. Das Vollbad ist in jeder Hinsicht gründlicher. Das automatisch dosierte alkalische Reinigungsbad reinigt die Pipetten bei bis zu 95° C und spült sie innen wie außen entsprechend bekannter Erfahrungswer-te. Darüber hinaus können alle Parameter von der Laborleitung neu definiert werden. Die Konzen-tration der Badlauge sowie die Verweilzeit beim Bad oder bei der Spülung, bestimmen letztend-lich über den Grad der Pipettensauberkeit. Die automatische Trocknung der Pipetten findet bei 130° C im selben Zyklus statt. Die Bedienung ist vergleichbar mit der eines Geschirrspülers. Das heißt: das gewünschte Programm wird gewählt oder wiederholt und über die Starttaste einge-leitet. Der Ablaufstatus wird über Leuchtdioden angezeigt.

Gewo-Feinmechanik GmbHMaria GrafTel.: +49-(0)-8122-9748-0Fax: +49-(0)[email protected]

Mit Enhanced Biobanking stellt die in Hen-ningsdorf ansässige in.vent Diagnostica GmbH ein ISO-zertifiziertes System zur Ge-winnung neuer Biomarker vor. Die besonde-ren Vorteile liegen in der gezielten Probenge-winnung unter definierten prä-/analytischen Bedingungen und im IT-unterstützten sowie verlinkten Probenmanagement. So lassen sich nicht nur individuelle Protokolle über das Probenhandling anfertigen, auch das Erstellen einer umfassenden, projektorien-tierten Probendokumentation wird möglich. Auf diese Weise können anschließend indi-kations-, parameter- oder matrixbezogene Kollektive genauer betrachtet werden.

Enhanced Biobanking bietet eine völlig neue Qualität in der Bereitstellung humaner Proben. Gerade wegen immer neuer Fortschritte auf dem Gebiet der Entdeckung und Entwicklung von Biomarkern steigt der Bedarf an nativen Proben. Mit Enhanced Biobanking lassen sich die vielfältigsten Ansprüche an Volumen, Informationen, Matrices, Parameter sowie Behandlung erfüllen.

Das Enhanced Biobanking ermöglicht die effi-ziente Durchführung klinisch-diagnostischer Studien im Bereich der in-vitro-Diagnostik und der personalisierten Medizin durch die ziel- und projektorientierte Bereitstellung humaner Proben. Seit 2009 ist in.vent nach DIN EN ISO 9001:2008 und nach DIN EN ISO 13485:2007 zertifiziert. Es verfügt über ein schlankes Qualitätsmanagementsystem, basierend auf einem prozessorientierten Ansatz.

in.vent Diagnostica GmbHChristiane EwelTel.: +49-(0)3302 55 199-23Fax: +49-(0)3302 55 [email protected]

PromoCell bietet ein umfassendes Portfolio an adulten humanen Stammzellen inklusive der zugehörigen Expansions- und Differenzierungs-medien für Forschungsprojekte an. Dazu gehören Perizyten, mesenchymale Stammzellen, hämato-poetische Stammzellen, Monozyten und Dendriti-sche Zellen sowie mononukleäre Zellen.

Perizyten und mesenchymale Stammzellen (MSC) sind multipotente Zellen, die sich in eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen differen-zieren können. Das Portfolio von PromoCell reicht von humanen Perizyten aus der Plazen-ta bis zu mesenchymalen Stammzellen aus

Promocell

Arbeiten mit Stammzellen

unterschiedlichen Geweben. Beide Zelltypen können mit den zugehörigen PromoCell-Wachs-tumsmedien problemlos expandiert werden. Zusätzlich sind Differenzierungsmedien zur in-vitro-Differenzierung von MSC in Adipozyten, Osteoblasten, Chondrozyten und neuronale Zellen verfügbar.

PromoCell CD133+ und CD34+ hämatopoeti-sche Stammzellen werden aus frischem Nabel-schnurblut isoliert. Im chemisch definierten und xeno-freien PromoCell HPC-Expansion-Medium DXF können diese primitiven Blutstammzellen unter definierten Bedingungen effizient ex-pandiert werden. Mononukleäre Zellen (MNC) aus Nabelschnurblut und peripherem Blut sind ebenfalls verfügbar.

Monozyten (Mo) sind unreife, multipotente Phagozyten und werden aus peripherem Blut aufgereinigt. Sie kommen oft in immunolo-gischen Studien zum Einsatz und eignen sich zudem für die Differenzierung zu Makrophagen, Osteoklasten und myeloiden dendritischen Zellen (mDC). PromoCell bietet ein komplettes Kultursystem zur Herstellung von mDC aus Mo und MNC an.

PromoCell GmbHBritta Carolyn KrauseSickingenstr. 63/65 69126 HeidelbergTel.: +49 (0) 6221-649 34-36 Fax: +49 (0) 6221-649 34-40www.promocell.com www.promokine.info

in.vent Diagnostica

Ausgereiftes ISO-zertifiziertes System zur Gewinnung neuer Biomarker

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Service Produktwelt

Die Kernkompetenz des europäischen Markt-führers BST Bio Sensor Technology, liegt in der Konzeption, Entwicklung sowie der automati-sierten Produktion von Mehrweg-Biosensoren. „Mehrweg-Biosensor“ deshalb, weil der Bio-sensor nach einer kurzen Reinigung wieder einsatzbereit ist. Je nach Anwendungsbereich, können die Sensoren bis zu fünftausendmal wiederverwendet werden.

Die daraus resultierenden Vorteile der Tech-nologie sind zum einen eine Qualitätsverbes-serung durch die Möglichkeit der Kalibration und Kontrolle des Biosensors, zum anderen eine verbesserte Kosteneffizienz durch die mehrfache Verwendung eines Biosensors.

Die BST-Biosensoren sind für die Bestim-mung von millimolaren Konzentrationen (zum Beispiel Glukose in Vollblut) bis zu picomolaren Konzentrationen (zum Beispiel Hormone) von Substanzen geeignet.

Zu den neuesten BST-Produkten gehören professionelle Analysegeräte. Das mobile Gerät GLUKOMETERPRO arbeitet mit einem Mehrweg-Glukosesensor und unvorbehandel-tem Vollblut und bringt damit Laborqualität aus dem klinischen Labor in den POCT-Bereich. Für die Laboratoriumsdiagnostik wird der LABTREND zur flexiblen und ökonomischen Bestimmung von Glukose- oder Laktat-

Konzentrationen in Blut, Plasma oder Serum angeboten. BST Bio Sensor Technology ist Mit-glied im Berlin-brandenburgischen Verband Diagnostik Net | BB.

BST Bio Sensor Technology GmbHDr. Dorothea ZahnBuchholzer Str. 55-6113156 BerlinTel.: +49-(o)30-7676-731-0Fax.: +49-(0)[email protected]

BST Bio Sensor Technology

Mehrweg-Biosensoren für Labor, POCT, Prozesskontrolle und Forschung

Attomol bietet CE-zertifizierte Quicktype-Tests zur Bestimmung des genetischen Risi-kos von Gerinnungsstörungen an, die jetzt teilautomatisiert mittels Kapillarelektropho-rese ausgewertet werden können. Besonders bei hohem Probenaufkommen reduziert die-ses System den Arbeitsaufwand und verein-facht die Bewertung und Dokumentation der Ergebnisse gegenüber der herkömmlichen Auswertung im Agarosegel.

Neben den bisher schon etablierten Pa-rametern hat Attomol seine Produktpalette kürzlich um zusätzliche Tests zur Bestim-

mung von Faktor II Prothrombin 19911A>G, Faktor V HR2 6755A>G und FSAP Marburg I erweitert.

Genetische und immunologische Faktoren aber auch der Lebensstil oder die Lebenssitua-tion nehmen Einfluss auf das Gerinnungssys-tem, welches für die Balance des Blutes sorgt und das sowohl Blutungen als auch Thrombo-sen mit schlimmstenfalls tödlichem Verlauf entgegenwirkt. Die Änderung des Lebensstils oder die Gabe von Gerinnungshemmern kön-nen das Thromboserisiko minimieren. Atto-mol ist Mitglied im Berlin-brandenburgischen Verband Diagnostik Net | BB.

Attomol GmbHDr. Werner LehmannSchulweg 6, Lipten03205 BronkowTel.: +49-(0)35329-5906-0Fax: +49-(0)[email protected]

Attomol

Genetisches Risiko für Blutgerinnungsstörungen mittels Kapillarelektrophorese bestimmen

Medipan

Immunfluoreszenzbilder automatisiert auswertenDie von MediPan entwickelte AKLIDES-Tech-nologie ermöglicht es weltweit erstmalig, dass verschiedenste diagnostische Tests über Immunfluoreszenznachweis automatisch und objektiv auswertbar sind. Nach jahrelanger Forschungsarbeit und partnerschaftlicher Zusammenarbeit mit anderen Firmen ist es gelungen, eine marktfähige Plattformtechno-logie für die digitale Immunfluoreszenz mittels intelligenter mathematischer Bildverarbei-tungsalgorithmen zu entwickeln.

Die Auswertung zellbasierter Immunfluoreszenz-tests (AKLIDES Kyto) stellt die Basistechnologie für das AKLIDES-System dar und wird bereits er-folgreich in der medizinischen Routinediagnostik eingesetzt. Bisher entwickelte Erweiterungen wie das AKLIDES Beads zur Auswertung von Multiplextesten in der Autoimmundiagnostik und das AKLIDES Nuk zum Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen ermöglichen auch in diesen Bereichen der Diagnostik eine objektive Auswertung. Die AKLIDES-Plattformtechnologie ermöglicht schon heute die Kombination von hochsensitiven zellbasierten Tests, zum Beispiel mittels HEp-2-Zellen mit der hochspezifischen Beadtechnologie auf einem Gerät. Die auto-matische Auswertung von DNA-Doppelstrang-brüchen über H2AX Foci könnte zukünftig eine individuelle Strahlentherapie für Krebspatienten ermöglichen.

Weitere Indikationsmöglichkeiten im Be-reich Kardiologie, Virologie und Mikrobiologie werden zu den zukünftigen Entwicklungen für die Plattformtechnologie gehören. Medipan ist Mitglied im Berlin-brandenburgischen Verband Diagnostik Net | BB.

MEDIPAN GmbHLudwig-Erhard-Ring 315827 Dahlewitz / BerlinTel.: +49 (0) 33708 4417 - [email protected]

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Service Kalender


Oktober 2011 – Dezember 2011

Veranstaltungskalender

1. Dezember 2011, Würzburg

Neue Wirkstoffe

Themenschwerpunkte des 5. Kooperations-forums Drug Development sind Strategien der Wirkstoffentwicklung in Industrie und Wissenschaft, Technologieplattformen für die Forschung sowie neue Wirkstoffe. Info: bayern-innovativ.de/drugdevelopment2011

22.–23. November 2011, Dessau

Biopharmazeutika

Die Konferenz Vaccines and Biologics be-leuchtet aktuelle Fragen zur Entwicklung von Biopharmazeutika. Insbesondere geht es um Möglichkeiten, die Medikamen-tenentwicklung zu beschleunigen, um moderne mikrobiologische und analytische Methoden sowie um moderne Formen der Prozessvalidierung, beispielsweise durch Quality by Design. Info: www.vaccines-conference.org/

2.–4. November 2011, Leipzig

Regenerative Medizin

Der Weltkongress der Regenerativen Me-dizin 2011 in Leipzig versammelt Experten aus aller Welt, um über neueste Entwick-lungen in den verschiedenen Fachgebie-ten zu diskutieren. Ein Schwerpunktthema sind Advanced Cell Therapies. Info:www.wcrm-leipzig.com/

26.09.11Tag der Genomforschung, BerlinInfo: Dr. Silke Argo , Nationales Genom-forschungsnetz - NGFN (E-Mail: [email protected],Web: www.ngfn.de/jubilaeum/)

31.10.-02.11.11BIO-Europe 2011, DüsseldorfInfo: Thomas Voigt, EBD Group(Tel.: +1-760-930-0500,E-Mail: [email protected],Web: www.ebdgroup.com/bioeurope)

02.-04.11.11World Conference onRegenerative Medicine 2011, LeipzigInfo: Jens Augustin, Fraunhofer Institute forCell Therapy and Immunology IZI(Tel.: +49 (0)341 35536-9320,Web: www.wcrm-leipzig.com)

02.-03.11.113. Symposium Energiepflanzen, BerlinInfo: FNR/BMELV (E-Mail: [email protected],Web: www.fnr.de/energiepflanzen2011/)

03.11.11Fraunhofer Life Science Symposium, LeipzigInfo: Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immu-nologie, Leipzig(E-Mail: [email protected],Web: www.fs-leipzig.com)

04.-05.11.1112th EMBO|EMBL Science & SocietyConference: Making Sense of Mental Illness: Biology, Medicine and Society, HeidelbergInfo: EMBO/EMBL(Web: www.embo.org/science-society-conference-2011)

05.11.11Biologie und Bioökonomie –Tag der Biowissenschaften 2011, BerlinInfo: VBIO(Web: www.tag-der-biowissenschaften.de)

08.-10.11.11Journées Internationales Biologie – JIB 2011, Cnit / Paris la Défense (F)Info: Reed Expositions France(Tel.: +33-1-4756-5079, E-Mail: [email protected], Web: www.jib-sdbio.fr)

08.11.11Einführung in die „Gute Laborpraxis“,KarlsruheInfo: Eva Balog, Karlsruher Institut für Technik und Umwelt (KIT) (Web: www.fortbildung.kit.edu)

09.-10.11.113. Potsdamer Bioanalytik Kolloquium,2. Statusseminar „Das Taschentuchlabor“, PotsdamInfo: ZMDB/BioTOP(Web: www.zmdb.de/bioanalytik2011)

09.11.11Integrated Testing Strategies and Their Im-pact on the 3Rs, Brüssel (B)Info: EPAA (E-Mail: [email protected],Web: http://ec.europa.eu/enterprise/epaa)

10.-11.11.11Leachables and Extractables – Testing &Assessment, BerlinInfo: CONCEPT Heidelberg GmbH(Web: www.gmp-navigator.com)

14.-16.11.11NanoBioTech Montreux 2011, Montreux (CH)Info: Scitech Research SA (Tel.: +41 21 624 15 33, E-Mail: [email protected],Web: www.nanotech-montreux.com)

15.11.11T5 JobMesse der Healthcare-Branche,MünchenInfo: T5 Interface GmbH (E-Mail: [email protected], Web: www.t5-futures.de)

15.11.11From Bench to Bedside, Focus: Innovative Applications in Personalised Medicine,DortmundInfo: Protagen AG (Web: www.biotechnologie-dortmund.de)

16.-18.11.11COMPAMED/MEDICA 2011, DüsseldorfInfo: Dana Mell, IVAM (E-Mail: [email protected],Web: www.ivam.de)

16.-17.11.11Targeted Antibodies for Cancer 2011 – TAC 2011, London (UK)Info: MA Healthcare Conferences(Web: www.mahealthcareevents.co.uk/TAC2011)

19.-20.11.11Paul Martini Symposium 2010: Innovative Therapien in der Hepatologie, BerlinInfo: Paul-Martini-Stiftung (E-Mail: [email protected], Web: www.paul-martini-stiftung.de)

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Ausblick

InserentenverzeichnisAnalytik Jena AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13Astra Biotech GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23Beckman Coulter GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . 21Berlin Partner GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . U3Biotechnologische Studenteninitiative . . 33Candor Bioscience GmbH . . . . . . . . . . . . . . . 9DASGIP AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17Gewo-Feinmechanik GmbH + H . Hölzel GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Karl Th . Plato KG / Lallemand Bio-Ingredients . . . . . . . . . . . . . . 11Kimberly Clark Professional . . . . . . . . . . . . . 25Kraeber GmbH & Co . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29Licor Biosciences GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . 27New England Biolabs GmbH . . . . . . . . . . . . U4Norgenta GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24Olympus Deutschland GmbH . . . . . . . . . . . 5Peprotech GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15Porvair Sciences Ltd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Promocell GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18Roche Diagnostics GmbH . . . . . . . . . . . . . . . U2Sony DADC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7S4L - Science for Life . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37SOCOREX ISBA S .A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Sequenzierung erreicht das Gesundheitswesen von Thomas Gabrielczyk, Redaktion LABORWELT

Mit lauten vernehmbarem Krachen haben Mikrobiologen, Epidemiologen und Vertreter der Gesundheitsbehörden WHO, FDA, CDC, ECDC und der Europäischen Kommission eine Lan-ze für die Erregerdiagnostik und Seuchenüberwachung per Next-Generation-Sequencing (NGS) gebrochen. Ende September berichtete das Wissenschaftsjournal Science (Vol 333, Seite 1818-1819) von ihrem revolutionären Vorschlag, die mikrobiologischen Stammsammlungen mittelfristig durch eine global zugängliche Datenbank zu ersetzen, die die Genomsequenzen aller bekannten mikrobiellen Pathogene enthält. Diese wollen sie nutzen, um per schnellem Sequenzabgleich Ausbrüche künftig schneller diagnostizieren und ihre Ausbreitung quasi in Echtzeit überwachen zu können. Ihr Ziel sei binnen fünf bis zehn Jahren erreichbar, je nach finanzieller und politischer Unterstützung, so die Experten. Auch den Prototyp einer solchen Erregerdatenbank inklusive der für Ärzte erforderlichen bioinformatischen Tools gibt es bereits. Er steht am National Food Institute der Technischen Universität Dänemark in Kopenhagen. Allerdings haben die Experten einige Widerstände zu überwinden, bevor ihre Idee sich bei Ärzten, Diagnostiklabors, Gesundheitsbehörden und in der wissenschaftlichen Gemeinde durchsetzt. Den Anbietern billiger Kompakt-NGS-Instrumente eröffnet die Initiative den Markt der mikrobiellen Erregerdiagnostik.

„Motor der Entwicklung ist der Preisverfall bei den Desktop-Next-Generation-Sequenzern“, so Dag Harmsen von der Universität Münster . Während die Hochdurchsatzsequenzer der drei großen Anbieter Roche, Illumina und Life Technologies/ABI einen Markt von vielleicht 500 Sequenzierungszentren mit entsprechen-der Finanzkraft addressieren, „kann sich jedes Krankenhauslabor einen Kompaktsequenzer leisten“ . Wie schnell und billig die kleinen Geräte arbeiten, hatte Harmsens Gruppe bei der EHEC-Epidemie in Deutschland und einem Klebsiella-Ausbruch in den Niederlanden demonstriert . Derzeit liegen die Kosten zwar noch bei 500 Euro pro Genom . Laut Harmsen werden sie mit 100 bis 200 Euro aber genau-soviel kosten wie der derzeitige Goldstandard der Erregerdiagnostik, die Pulsfeld-Gelelektro-phorese (PGFE) .

Wann auch immer einem Diagnostiklabor oder Krankenhaus ein Isolat vorliegt, wird es in wenigen Stunden sequenziert werden . Danach

LABORWELT (ISSN 1611-0854) erscheint zweimonatlich im Verlag der

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ThemaSynthetische und System-Biologie/Von der Gensynthese über Tools zur Ana-lyse und zum gezielten Ausschalten von Genen, DNA-Methylierung, Proteinen sowie Metaboliten und der bioinformatischen Integration in biologische Modelle – die nächste LABORWELT-Ausgabe präsentiert top-aktuelle Themen zum Zukunftsthema Synthetische Biologie/Systembiologie .

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Vorschau Heft 6/2011kann per Smartphone die Sequenz mit der globalen Datenbank abgelichen werden, und binnen Minuten ist der Erreger inklusive An-tibiotikaresistenzen ermittelt“, erklärt Jørgen Schlundt, Direktor des National Food Instituts, der nach Brüssel eingeladen hatte, die Vision . Ein großes Problem seien aber die national unterschiedlichen Datenschutzbedürfnisse, die bedient werden müssten, um eine global zugängliche Datenressource vorhalten zu können, so Schlundt . Auch müsse sich die Publi-kationspraxis jener von Open Access-Journalen angleichen, die Publikationen auch dann akzep-tieren, wenn die Sequenzdaten zuvor öffentlich zugänglich gemacht worden seien .

Vertreter der Europäischen Kommission halten sich hinsichtlich der Finanzierung des Konzeptes noch bedeckt . Doch wird derzeit kräftig in andere Infrastruktursprojekte investiert, die auf die Etablierung allgemein zugänglicher Sequenzdatenbanken abzielen, wie etwas das ELIXIR-Projekt .

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LABORWELT 05/2011