1

Immunologie

in der Labormedizin

Konteptvorlesung 2

Themenblock 8 Beda M. Stadler

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KV 8.2 2

KV2 im Überblick

• Was sind Immunassays?

• Was versteckt sich hinter

den Abkürzungen?

• Assay Beispiele um

immunologische

Prinzipien zu vertiefen

• Aussagekraft von

Labordaten

• Vertrauensgrenzen

Lernziele: Immunologie in der Labormedizin

2

KV 8.2 3

Was ankreuzen?

KV 8.2 4

3

Selbststudium:

de.wikipedia.org/wiki/Immunoassay

Allgemeine Grundlagen

• Analyt

• Detektionstechniken

• Feste Phase

• Quantifizierung

Assay-Prinzipien

• Kompetitiver Assay

• Nicht-kompetitiver Assay

• Direkter Assay

KV 8.2 5

KV 8.2 6

KV2 im Überblick

• Präzipitationsteste

• Agglutinations Teste

• Antigen-Antikörper Teste • Allgemein

• Allergie Diagnostik

• Flowzytometrie

• HLA Diagnostik

• Autoimmun Diagnostik

• Sensitivität und Spezifität von Labortesten

Immunologie in der Labormedizin

4

KV 8.2 7

Identität

1

A

4

2

3

6

5

Partielle Identität

1

A

4

2

3

6

5

Keine Identität

1

A

4

2

3

6

5

Immunodiffusion

(Ouchterlony Gel)

A

1

2

Antigen

Kontrollserum

Testserum

KV 8.2 8

Antigen

Präzipitinkurve

+ Anti-A

Anti-B

Anti-C

C B

A

Antikörper Immunkomplex

Imm

un

ko

mp

lex

Antigen

Prozone Postzone

Äquivalenz

5

KV 8.2 9

Radiale Immunodiffusion

Antigen Konzentration

Dia

mete

r2

Ag Ag Ag Ag

Antikörper im Gel

KV 8.2 10

Serum Elektrophorese

gamma

beta

alpha2

alpha1

Albumin

-

+

Globuline

Paraproteinämie-Patient

6

KV 8.2 11

Immun-Elektrophorese

IgA Albumin Transferrin IgG IgM

+

Normales Serum

Patienetenserum mit IgA Mangel

Antikörper gegen Serumproteine

-

Beispiel

KV 8.2 12

Direkter Coombs Test

7

KV 8.2 13

Der indirekte Coombs Test

Patienten

Serum

Erythrozyten

+ Step 1

+

Coombs Reagens

(Antiglobulin)

Step 2

z.B. anti-RhD Antikörper

KV 8.2 14

Passive Hämagglutination (Beispiel: Anti-Syphilis Antikörper)

8

KV 8.2 15

Latex Agglutination

KV 8.2 16

Blutgruppenbestimmung: Geltechnik

Resultat:

Blutgruppe A RhD neg

monoklonaler Antikörper

gegen Blutgruppen A Antigen

in der oberen Gelmatrix

9

KV 8.2 17

z.B. Schwangerschaftstest

rapid determination of human chorionic gonadotropin (hCG)

in urine specimens

Primary antibodies (anti-hCG labelled or on solid phase)

Secondary antibodies (anti-Ig on solid phase)

KV 8.2 18

Allergieserologie: welcher Test?

Anti-b2-Glycoprotein 1 (IgG) ELISA

U/ml

<15

Cardiolipin-Antikörper (IgG) SYNELISA

GPL-U/ml

<12

ECP ("eosinophil cationic protein") FEIA

g/L

2.5-15

Tryptase FEIA

g/L

1-13.5

Methylhistamin RIA

µg/g Kreatinin

70-160

Total IgE FEIA

kIU/L

(altersabhängig)

Allergen-spezifisches IgE

(RAST)

FEIA

Rastklassen 0-6

0

Allergen-spezifisches IgG FEIA

mg/L

< 50 mg/L

Präzipitine Immundiffusion

qualitativ

negativ

Analyse Messprinzip Masseinheit Referenz-

bereich

10

KV 8.2 19

KV 8.2 20

Isotop Enzyme

Messung der Radioaktivität

oder Enzymaktivität

Immun Assay: RIA & ELISA

• Enzyme

• Linked

• Immuno

• Sorbent

• Assay Antikörper Antigen

markierter

Antikörper

• Radio

• Immuno

• Assay

11

KV 8.2 21

ELISA

Anti-A

Markierter Antikörper

A

Enzym

Substrat

Produkt

KV 8.2 22

Sandwich ELISA

Anti-A

Anti-Antikörper

A

Enzym

Substrat

Produkt

12

KV 8.2 23

Standardisierung

KV 8.2 24

Beispiel: Flowzytometrie

Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich

HLA-B27

Zytofluorometrie

qualitativ

positiv/negativ

Lymphozyten

Zytofluorometrie

Zellen/l

1200-2800

CD3 absolut

Zytofluorometrie

Berechnung

Zellen/l

% der Lymphozyten

690-2540

55-84

CD4 absolut

Zytofluorometrie

Berechnung

Zellen/l

% der Lymphozyten

410-1590

31-60

CD8 absolut

Zytofluorometrie

Berechnung

Zellen/l

% der Lymphozyten

190-1140

13-41

NK-Zellen

Zytofluorometrie

Berechnung

Zellen/l

% der Lymphozyten

90-590

5-27

B-Zellen

Zytofluorometrie

Berechnung

Zellen/l

% der Lymphozyten

90-660

6-25

13

KV 8.2 25

sample

red fluorescence

sorted cells

sheet flow

nozzle

laser

forward scatter

right angle scatter

green fluorescence

prism

FACS

Fluorescence Activated Cell Sorter

KV 8.2 26

Zellpopulationen

?

14

KV 8.2 27

CD-Antikörper

CD

Antigen Funktion Vorkommen

CD 2 Rezeptor für CD 58 (LFA-3), alternativer

Aktivierungsweg von T-Lymphozyten unreife und reife T-lymphozyten

CD 3 T-Zell-Rezeptor-assoziierte polypeptidketten,

Signaltransduktion reife T-Lymphozyten

CD 4 assoziative Erkennungsstruktur (Bindung an

MHC-Klasse II Moleküle), HIV-Rezeptor T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen

CD 8 Bindung an MHC-Klasse I Moleküle zytotoxische T-Lymphozyten

CD 14 Rezeptor für bakterielles Endotoxin

(LPS=Lipopolysacharid) Monozyten, Makrophagen

CD 16 Fc-gamma Rezeptor III NK-Zellen, Monozyten-Subpopulationen,

Makrophagen

CD 23 niedrig affiner (bindender) Rezeptor für IgE B-Lymphos, follikuläre dendritische Zellen (=FDC)

CD 25 Interleukin-2-Rezeptor aktivierte T-Lymphozyten

IgM Antigenrezeptor unreife + reife B-Lymphos

IgD Antigenrezeptor reife B-Lymphos

HLA-DR MHC-Klasse II Moleküle, Bindung von

Antigenpeptiden

AG-präsentierende Zellen (dendritische Zellen,

Monozyten, B-Zellen), aktivierte T-Lymphos

KV 8.2 28

Eine Immunantwort verfolgen

15

KV 8.2 29

CD-Marker bei der Diagnose von

lymphohämopoietischen Erkrankungen

Stammzelle Prä-B. frühe B. mittlere B. reife B. plasmozytoide B. Plasmazelle

ALL PLL, Burkitt

Lymphom

CLL,

foll. L.

Haarzell-

L.

Waldenström Myelom

CD19

CD 20

CD 34

CD 52

CD138

KV 8.2 30

Beispiel: HLA Typisierung

Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich

HLA-B27

Zelllyse

qualitativ

positiv/negativ

HLA-Typ I (A, B, C) (serologisch) Zelllyse

qualitativ

Phänotypisierung

HLA-Typ I (A, B)

PCR-SSP

qualitativ

Phänotypisierung

HLA-Typ II (DR)

PCR-SSP

qualitativ

Phänotypisierung

HLA-Typ II (DQ)

PCR-SSP

qualitativ

Phänotypisierung

HLA-Typ II (DP)

PCR-SSP

qualitativ

Phänotypisierung

HLA-Typ Organempfänger

PCR-SSP

qualitativ

Phänotypisierung

T-Zell Cross-match

Zelllyse

qualitativ

negativ

B-Zell Cross-match

Zelllyse

qualitativ

negativ

Leukozytenantikörper

Zelllyse

qualitativ

negativ

16

KV 8.2 31

HLA Typisierung einst...

KV 8.2 32

Überlebensrate Nierentransplantate

Number of HLA mismatches

A & B DQ & DR

0 0

A & B DQ & DR

3 or 4 1 or 2

17

KV 8.2 33

HLA-B27 Typisierung mittels FACS

KV 8.2 34

HLA Typisierung serologisch

18

KV 8.2 35

PCR

KV 8.2 36

HLA: Molekulare Diagnostik

19

KV 8.2 37

Array Technologie

„DNA Chips“

KV 8.2 38

Western Blot: Prinzip

20

KV 8.2 39

HIV: Western Blot

1. Lane 1, HIV+ serum

(positive control)

2. Lane 2, HIV- serum

(negative control)

3. Lane A, Patient A

4. Lane B, Patient B

5. Lane C, Patient C

KV 8.2 40

Beispiel: Autoimmunserologie

Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich

Rheumafaktor

Nephelometrie

IU/ml

< 20

Zellkerne (ANA)

IIF

Titer

< 1:80

Thyreoidea Thyroglobulin

Agglutination

Titer

< 1:400

C1-Esteraseinhibitor

(funktionell)

Fotometrie

% des

Normwertes

70-130%

C1q-tragende Immunkomplexe

ELISA

g/ml

< 35

Hautbiopsie

DIF

qualitativ

negativ

Schleimhautbiopsie

DIF

qualitativ

negativ

21

KV 8.2 41

Nephelometry

KV 8.2 42

Immunfluoreszenz

Antinukleäre Antikörper (ANA)

Ag

Fluorochrom

markierter AK

Gewebe

22

KV 8.2 43

In situ Hybridisierung

KV 8.2 44

FISH

23

KV 8.2 45

FISH Beispiel

Fluorescent in situ

hybridisation of a

small intestinal biopsy

in a case of Whipple's

disease (confocal laser

scanning microscopy).

Tropheryma whipplei

rRNA is blue, nuclei of

human cells are green

and the intracellular

cytoskeletal protein

vimentin is red.

Magnification

approximately 200 x.

KV 8.2 46

Immunhistochemie

Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink)

in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody

against cytokeratin (green)

24

KV 8.2 47

Sensitivität und Spezifität

• Sensitivität (epidemiologisch)

• Sensitivität (analytisch)

• niedriger Titer

• Serokonversion

• Verdünnung

KV 8.2 48

oder...

• Sensitivität = Wahrscheinlichkeit,

dass Test bei kranken Personen

positiv ausfällt

• Spezifität = Wahrscheinlichkeit, dass

Test bei gesunden Personen negativ

ausfällt

25

KV 8.2 49

Genauigkeit der Labordiagnostik

X 100%

Anzahl richtig positiver

(Anzahl richtig positiver + Anzahl falsch negativer)

Sensitivität =

X 100% Spezifität =

Anzahl richtig negativer

Anzahl richtig negativer + Anzahl falsch positiver

Beispiel

Tatsächlicher Sachverhalt

positiv

(krank)

negativ

(gesund) Gesamt

Testergebnis

positiv

(krank)

richtig positiv

95

falsch positiv

30

125

negativ

(gesund)

falsch negativ

5

richtig negativ

270

275

Gesamt 100 300 400

KV 8.2 50

Sensitivität: 95 %

Spezifität: 90 %

26

KV 8.2 51

Aussagekraft der Labordiagnostik

echt Positive + falsch Positive

echt Positive X 100%

positiver

prädiktiver Wert =

echt Negative + falsch Negative

echt Negative X 100%

negativer

prädiktiver Wert =

HIV Testung bei der

Gesamtbevölkerung (82Mio)

HIV positiv HIV negativ

HIV-Test

positiv 66 933 82 000 148 933

HIV-Test

negativ 67

ca. 82

Mio

Summe 82 Mio

KV 8.2 52

Falls Sensitivität und Spezifität = 99.9%

positive Vorhersagewert beträgt nur 45 %!

27

KV 8.2 53

KV2 im Rückblick

Immunologie in der Labormedizin

• Traditionelle Serologie

• Moderne

immunologische Teste

• Molekularbiologische

Methoden

• Outlook: Point-of-care

testing ?

Immunologie Wahlpraktikum 3. Studienjahr 2004

„Ein Einblick in die Labormedizin“

http://www.immunology.unibe.ch/wiki/?p=teaching/medical_students/practicle&l=de