STICKSTOFFMONOXYD (NO)

Intra- und interzellulärer Botenstoff

- Nicht nur im Gefäßsystem -

1962

Chemische und physikalische

Eigenschaften von N=O.- Radikalisches Gas (ungepaartes Elektron)

- relativ “unreaktiv” im Vergleich zu z.B. Superoxydanion (O )

- hoch diffussibel auf Grund des niedrigen MW, Hydrophobizität

und Löslichkeit

- t1/2 = sec. Inaktivierung zu nicht reaktivem Nitrit (NO -)

oder Nitrat (NO -) oder Umwandlung zu reaktivem NO oder NO

- kein "echter" Rezeptor, Wirkung durch Nitrosylierung von

z.B. Metallen, SH-Gruppen (Cystein)

-

2

2

3

-

- +

hohe Affinität zu Häm-Gruppen

Historie der Entdeckung von NO als zelluläre Signalsubstanz

Seit Beginn des Jahrhunderts:- Einsatz von Nitroverbindungen wie Nitroglycerin oder Nitroprussit bei der Behandlung von Angina und anderen koronaren Herzkrankheiten als vasodilatorische Medikamente

1960-1970:- Entdeckung von cyclischem GMP- Guanylylcyclase- cGMP abhängiger Proteinkinase (PKG)- cGMP-spezifischer Phosphodiesterase

Nobelpreis 1998- Furchgott, Ignarro and Murad für Arbeiten zu NO als cGMP vermittelte, vasodilatorische Signalsubstanz (EDRF = Endothelium-Derived-Relaxing-Factor)

N=O.

NO-regulierte oder modulierte Prozesse

Entzündung

Zytotoxizität(Tumor, Pathogens)

Apoptose

Muskelrelaxierung(glatte Muskulatur)

Proliferation von glatten Muskelzellen

Plättchenaggregation

NO-Synthese aus Arginin und Sauerstoffdurch NO-Synthasen (NOSs)

Für die Redox-Reaktionen werden benötigt: 1. Substrat: L-2. molekularer Sauerstoff3. Elektronen Donor: 4. Cofaktoren: Häm, FAD, FMN, Tetrahydrobiopterin und Ca /Calmodulin

2+

Arginin

NADPH

1. Oxygenase-Reaktion

Einbau von molekularem Sauerstoff

2. Reductase-Reaktion

Freisetzung von NO

NO-Synthese aus Arginin und Sauerstoffdurch NO-Synthasen (NOSs)

Für die Redox-Reaktionen werden benötigt: 1. Substrat: L-2. molekularer Sauerstoff3. Elektronen Donor: 4. Cofaktoren: Häm, FAD, FMN, Tetrahydrobiopterin und Ca /Calmodulin

2+

Arginin

NADPH

Struktur NO-Synthase (NOS)

NH2 COOH

NH2 COOH

Oxygenase-DomäneBindungsstellen:- Häm-Tetrahydrobiopterin- Substrat

regulatorische DomäneCalmodulin-Bindungsstelle

Reductase-DomäneBindungsstellen:- FAD- FMN- NADPH

Nitric Oxide Synthase Isoformen

Isoform Bezeichnung Zellfraktion Regulation MW

(kDa)

Gewebe

(Zellen)

NOS I bNOS Zytosol Ca2+/Calmodulin 155 Gehirn,

periphere

Neuronen,

Inselzellen

NOS II iNOS Zytosol Expression

induziert durch

Cytokine und

Endotoxin

125 Macrophagen,

Hepatozyten,

glatte Muskel-

zellen, etc.

NOS III eNos Membrangebunden Ca2+/Calmodulin 135 Endothelzellen,

Nierenepithel

Nitric Oxide Synthase Isoformen

Isoform Bezeichnung Zellfraktion Regulation MW

(kDa)

Gewebe

(Zellen)

NOS I bNOS Zytosol Ca2+/Calmodulin 155 Gehirn,

periphere

Neuronen,

Inselzellen

NOS II iNOS Zytosol Expression

induziert durch

Cytokine und

Endotoxin

125 Macrophagen,

Hepatozyten,

glatte Muskel-

zellen, etc.

NOS III eNos Membrangebunden Ca2+/Calmodulin 135 Endothelzellen,

Nierenepithel

Aktivierung von inducible NOS (iNOS) durch transkriptionale Induktion

R

INOS

INOS

PM

NO

iNOS

- Menge an gebildetem NO ca. höher als bei eNOS und bNOS- nur als Dimer aktiv- “pathophysiologische” NOS- Verantwortlich für z.B. septischer Schock verbunden mit Multi-Organversagen

1000 x

Mac

rop

ha

ge

Hep

at o

zy

t

Cytokine (IL-1ß, TNF , LPS)

iNOS mRNA

TF (z.B NF B)

+

Glucocortikoide

_

a

k

Nitric Oxide Synthase Isoformen

Isoform Bezeichnung Zellfraktion Regulation MW

(kDa)

Gewebe

(Zellen)

NOS I bNOS Zytosol Ca2+/Calmodulin 155 Gehirn,

periphere

Neuronen,

Inselzellen

NOS II iNOS Zytosol Expression

induziert durch

Cytokine und

Endotoxin

125 Macrophagen,

Hepatozyten,

glatte Muskel-

zellen, etc.

NOS III eNos Membrangebunden Ca2+/Calmodulin 135 Endothelzellen,

Nierenepithel

Aktivierung von eNOS durch Ca/Calmodulin2+

R

Ca2+

Hormon

[Ca]2+

Ca2+

NOS

NOSCa

2+

PM

NOeNOS

- Membranverankerung durch Myristinsäure

- Calmodulin Bindungs Domäne

- nur als Dimer aktiv

- constitutiv exprimiert

aktiv

Aktivierung von eNOS durch Ser-Phosphorylierung

R

Ca2+

Hormon

[Ca]2+

Ca2+

NOS

NOSCa

2+

PM

NOeNOS

aktiver

P

S

- Membranverankerung durch Myristinsäure-- Calmodulin Bindungs Domäne

- nur als Dimer aktiv

constitutiv exprimiert

-

Inaktivierung von eNOS durch Thr-Phosphorylierung

R

Ca2+

Hormon

[Ca]2+

Ca2+

NOS

NOSCa

2+

PM

NOeNOS

inaktiv

P

T

P

S

- Membranverankerung durch Myristinsäure-- Calmodulin Bindungs Domäne

- nur als Dimer aktiv

constitutiv exprimiert

-

N=O.

NO-Biochemische Interaktionen

Enzymaktivitäten

MitochondrialeAtmungskette

Lipide(Peroxydation)

Guanylycyclase

DNA (Strangbrüche)

Metalloproteine(Fe-S Gruppen)

+

Guanylylcyclasen

1.

= Guanylylcyclase-Rezeptoren

Transmembranrezeptoren mit intrinsischer,

intrazellulärer

.

Membrangebundene Guanylylcyclase

Cytosolische Guanylylcyclase

Guanylylcyclase Aktivität

- Rezeptoren für Natriuretische Peptide

z.B. ANP: (Synthese und Wirkung im Herz und Intestinaltrakt)

- durch NO stimulierbar

2.

= NO-regulierte Guanylylcyclase

nicht

GTP cGMP + PPi

NO-regulierte, lösliche Guanylylcyclase

- Heterodimer aus 76 kDa a-Untereinheit und

80 kDa ß-Untereinheit

- je eine Häm-Bindungs Domäne und eine

katalytische Domäne

- nur als Dimer aktiv

- die katalytische Aktivität wird durch die

NO-Bindung an die Häm-Gruppe 200-fach gesteigert

(Vmax und Km)

- cytosolisch lokalisiert, Isoformen auch

membranverankert

Protein “Targets” von cGMP

cGMP-abhängige Kinasen (cGKI und II)cGKI

NH2 COOH

NH2 COOH

N-terminale Domäne1. Dimerisierung2. Aktivierung/Inhibition3. Targeting

regulatorische Domäne- 2 cGMP-Bindungsstellen

katalytische Domäne

- Serin/Threonin Kinase- starke Expression in: glatte Muskelzellen, Plättchen, Nierengefässe, etc.

Funktionen cGMP-abhängiger Kinasen - cGKI und cGKII -

Ca -abhängige Kontraktion/Relaxierung der glatten Muskulatur

2+

Modulation der Ca -abhängigen Muskel-kontraktion durch cGMP-abhängige Proteinkinase (cGKI)

2+

- Inhibition der Ca -Freisetzung durch cGKI-Phosphorylierung:IRAG

BK

MBS/PP1M

2+

Ca

1. : IP -Rezeptor-assoziiertes cGKI Substrat

2. : Ca -abhängige K -Kanäle, Hyperpolarisierung, Inhibition von

L-Ca -Kanälen3. : Myosin-binding-unit der Myosin-Protein-Phosphatase

32 +

2+

Modulation der Ca -abhängigen Muskel-kontraktion durch cGMP-abhängige Proteinkinase (cGKI)

2+

- Inhibition der Ca -Freisetzung durch cGKI-Phosphorylierung:IRAG

BK

MBS/PP1M

2+

Ca

1. : IP -Rezeptor-assoziiertes cGKI Substrat

2. : Ca -abhängige K -Kanäle, Hyperpolarisierung, Inhibition von

L-Ca -Kanälen3. : Myosin-binding-unit der Myosin-Protein-Phosphatase

32 +

2+

Modulation der Ca -abhängigen Muskel-kontraktion durch cGMP-abhängige Proteinkinase (cGKI)

2+

- Inhibition der Ca -Freisetzung durch cGKI-Phosphorylierung:IRAG

BK

MBS/PP1M

2+

Ca

1. : IP -Rezeptor-assoziiertes cGKI Substrat

2. : Ca -abhängige K -Kanäle, Hyperpolarisierung, Inhibition von

L-Ca -Kanälen3. : Myosin-binding-unit der Myosin-Protein-Phosphatase

32 +

2+

→ Aktivierung

Protein “Targets” von cGMP

cGMP

5„GMP

cGMP und Phosphodiesterasen (PDE)Feedback-Loops und signal cross-talk

PDE I: Ca2+/Calmodulin abhängig

PDE II: nicht selektiv:

PDE III:

PDE IV: cAMP-spezifisch

cGMP-stimmulierbar,

cGMP-inhibiert, nicht selektiv

Crosstalk mit cAMP-Signalweg

PDE V: cGMP-stimmulierbar, cGMP spezifisch

Crosstalk mit cAMP-Signalweg

Struktur PDE V:positive Regulation durch allosterische cGMP-Bindung und Phosphorylierung

cGMP-abhängige Regulation von Phosphodiesterase Typ V:Negativer Feedback-Loop

Sildefanil = VIAGRA

Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction:Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion

NO cGMPsexuelle Erregung Ca2+

- Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cGMP-Hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung

Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction:Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion NO cGMPsexuelle Erregung Ca2+

- Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cGMP-Hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung

Corpus cavernosum

Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction:Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion

NO cGMPsexuelle Erregung Ca2+

- Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cGMP-Hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung

Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction:Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion NO cGMPsexuelle Erregung Ca2+

- Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cGMP-Hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung

Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction:Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion

NO cGMPsexuelle Erregung Ca2+

- Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cGMP-Hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung

Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction:Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion NO cGMPsexuelle Erregung Ca2+

- Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cGMP-Hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung