LABORWELT 01/2011

Assays & Automation Hochsensitiver Nachweis residualer Tumorzellen mit Amplikon-Fusion-Site-PCR

Paper des Monats: Erk-Pathway aktiviert bakterizide(s) NETs

Neues Echtzeitsystem zur präklinischen Testung der Kardiotoxizität

Marktübersicht:

Mikroskopie

Nr. 1 / 2011 – 12. Jahrgang

laborwelt

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Editorial | InhaltEditorial | Inhalt

LABORWELT 12. Jahrgang | Nr. 1/2011 | 3

Marktübersicht: Mikroskopie

Ob zur automatisierten Erfassung der Read-outs zellbasierter Assays, für Echtzeitüberwachungen der Rezeptorinternalisierung, physiologischer Veränderungen in der Zelle oder immunhisto-chemische Färbungen – die Mikroskopie tritt in der Life Sciences-Forschung und -Unternehmen vielgestaltig in Erscheinung. LABORWELT hat die Hersteller nach ihren Produktinnovationen gefragt. Die Antworten der Optikexperten und belastbare Informationen zu deren neuen Systemen finden Sie in dieser Marktübersicht ab Seite 36.

In diesem Heft

Neue Zellen braucht das Land!Zelltechnisch bereitet die Bundesregierung derzeit eine Neujahrsoffensive vor: An den fünf Standorten Berlin, Aachen, Würzburg, Kiel und Heidelberg sollen die bestehenden Biobanken gebündelt, standardisiert und fit für die vernetzte Nutzung gemacht werden. Ziel dabei: die vorhandenen Ressourcen für die Biomarkersuche nutzbar zu machen. Über den Sinn des Vorhabens, das in eine nationale Biomaterialbankinitiative münden soll, gibt es allerdings geteilte Meinungen. Während „Biobanker“ jubeln, ist Kritik aus den neuen Nationalen Zentren für Gesundheitsforschung zu vernehmen, an denen die bio-medizinische Expertise zu wichtigen Volks-krankheiten gebündelt werden soll (vgl. Seite 50). Die Phänotypisierung der Patienten, von denen die Biomaterialien stammen, sei oft ungenügend, heißt es, prospektive Kohorten, bei denen dies stärker berücksichtigt werde, seien daher wahrscheinlich mit größerem Nutzen verbunden.

Der immense Hype um die Biomarkersuche und um die dazu genutzten gesamtgenomischem Techniken beflügeln aber trotzdem die Forschung, wie diese Ausgabe über „Cell-based Assays & Automation“ zeigt. Firmen-gründer aus Radebeul etwa haben sich die Verbesserung des Gene Silen-cings (S. 10) auf die Fahnen geschrieben und vermarkten bereits „stabilere“, „spezifischere“ und „billigere“ siRNAs. Entgegen dem von Roche gesetzten Zeichen gegen die therapeutische Anwendung von siRNAs hat ein kleines kalifornisches Unternehmen mit einem deutschen CSO begonnen, einen vielversprechenden Weg zur systemischen Verabreichung von siRNAs klinisch zu testen (siehe S. 14) und Leipziger Wissenschaftler berichten von einem 100%ig spezifischen Nachweis residualer Krebszellen (vgl S. 6). Dies sind nur einige Highlights unserer Themenausgabe, zu der wir als neue Leser die Firmen des Netzwerkes DiagnostikNet-BB herzlich begrüßen. Viel Lesespaß wünscht Ihnen

Thomas Gabrielczyk

Titel: Automation & AssaysVon Neutrophil Extracellular Traps (NETs, gelb) eingefangene und abgetötete Shigella-Bakterien (orange). Neues zum Bildungs-mechanismus der bakteriziden DNA-Histon-Netze ab Seite 4.

Foto: Volker Brinkmann, MPI für Infektionsbiologie, Berlin

Inhalt

Paperwelt Highlight des Monats4 Erk-Pathway aktiviert Bildung antibakterieller NETs

Arturo Zychlinsky et al., MPI für Infektionsbiologie, Berlin

Wissenschaft Tumorzelldiagnostik6 Hochsensitiver Nachweis von Tumorzellen mittels Amplikon-Fusion-Site-PCR Axel Weber und Holger Christiansen, Universitäts- und Poliklinik für Kinder und Jugendliche, Leipzig

Blitzlicht HTS-siRNA10 Verbesserte zellbasierte siRNA-Screens im hohen Durchsatz

Jacques Rohayem et al., Riboxx GmbH, Radebeul

Blitzlicht Gene Silencing14 RNA-Interferenz – der Sprung vom Labor zum Menschen

Thomas Schluep, Calando Pharmaceuticals, Pasadena, CA, USA

Blitzlicht Automation17 Zellbasierte Assays im Nanoformat

Béatrice Schaack, Institut de Biologie Structurale, Grenoble; Wilfrid Weigel et al., Scienion AG, Dortmund

Report Einzelzell-Analytik19 Zellkommunikation als Bestandteil der mukosalen Immunabwehr

Tamas Dolowschiak, Mathias Hornef, Medizinische Hochschule, Hannover

Blitzlicht Zytotoxizitätstestung22 Ein Echtzeitsystem zur präklinischen Testung der Kardiotoxizität

Markus Scheuermann, Roche Applied Science GmbH, Penzberg

Blitzlicht Probenvorbereitung26 Einfluss der Proben quali tät auf die Ergebnisse zellbasierter Assays

Camilla Piper, Indivumed GmbH, Hamburg

Blitzlicht Antikörper-Optimierung29 Protein-Microarrays – Produktion, Qualität und Anwendungen

Stefan Müllner, Protagen AG, Dortmund

Blitzlicht Kongressreport32 SynBio: Immenser Fortschritt in der Signalling-Forschung

Tilman Brummer, BIOSS, Raphael Gübeli, SGBM, Wilfried Weber, BIOSS Freiburg

35 Labormarkt im Umbruch: Danaher schluckt Beckman Coulter

40 Karrierewelt: Auf nach Singapur

41 Stellenmarkt

45 Verbände

46 Produktwelt

49 Termine

50 Ausblick / Impressum

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Paperwelt Highlight des Monats

4 | 12. Jahrgang | Nr. 1/2011 LABORWELT

Prof. Dr. Arturo Zychlinksi studierte Che-mie, Bakteriologie und Parasitologie in Mexico City, bevor er an der Rockefeller University in New York über „Zelltod im Immuns ystem“ promovierte und als Post-Doc-Zeit drei Jahre an der Unité de Patho-génie Microbienne des Pasteur-Instituts in Paris forschte. Bevor er 2001 als Direktor an das Berliner Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie berufen wurde, forsch-te er vier Jahre als Assistenzprofessor und zwei Jahre als Associate Professor am Skirball Institute and Department of Microbiology, New York University School of Medicine. Seine Forschungsinteressen liegen auf den Gebieten NETs, Aktivie-rung des Inflammosoms, TLRs und Typ III-Sekretionssysteme.

LABORWELT:Warum ist es so wichtig, aber schwierig, NETs (Neutrophil Extracellular Traps) zu untersu-chen?

Zychlinski:Es ist wichtig wegen der Patienten, die Neutrophilen-Defekte haben und deshalb andauernd unter Infektionen leiden. Neu-trophile Granulozyten wehren Pathogene nicht nur durch Phagozytose ab. Einem vor gut sechs Jahren entdeckten Mechanismus zufolge schleudern sie beim Absterben auch netzartige Strukturen aus Nukleinsäuren, Histonproteinen und antibakteriellen En-zymen, wie neutrophiler Elastase, aus, die extrazellulär zur Pathogen-Abwehr beitra-gen. Wer zu wenige NETs bildet, bekommt immunologische Probleme.

Bisher war es schwierig die molekularen Grundlagen der NET-Bildung zu untersuchen, weil die Neutrophilen nach ihrer Bildung und Differenzierung im Knochenmark nur sechs Stunden im Blutkreislauf überleben. Deshalb ist ihre Untersuchung mit konven-tionellen genetischen Analysetechniken, wie Transfektion, Transduktion, gene knock down etc., nicht möglich. Dazu kommt, dass es keine Zelllinie gibt, die die antimikrobielle Aktivität der Neutrophilen zeigt. Deshalb haben wir einen Chemical Genomics-Ansatz

hibitoren zu finden, wollen wir einen weiteren, größeren Screen durchführen und Hemmstof-fe identifizieren, die weiter downstream in der Kaskade aktiv sind.

LABORWELT:Eröffnen Ihre Resultate bereits neue diagnos-tische oder therapeutische Anwendungen?

ZychlinskiEs wäre unverantwortlich zu sagen, wir hät-ten jetzt etwas in der Hand, das zum Beispiel gegen Sepsis helfen kann. Denn davon sind wir noch weit entfernt. Aber wir und andere Laboratorien haben Belege dafür, dass ein zu hoher Anteil von NETs eine Rolle bei Auto-immunkrankheiten wie systemischem Lupus erythematodes (SLE) oder bei Entzündungs-reaktionen wie der Sepsis spielt.

LABORWELT:Welches sind Ihre nächsten Forschungsziele?

ZychlinskiAm wichtigsten ist uns ein größerangelegtes Screening nach weiteren Inhibitoren, insbeson-dere hoffen wir, NET-spezifische Hemmstoffe zu finden. Den Screen möchten wir, wie schon bei dieser Arbeit, mit der Gruppe von Herbert Waldmann durchführen, die die entsprechende Chemie-Expertise einbringt.

Erk-Pathway aktiviert die Bildung neutrophiler extrazellulärer Traps Abdul Hakkim, Tobias A Fuchs, Nancy E Martinez, Simone Hess, Heino Prinz, Arturo Zychlinsky & Herbert Waldmann, Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation, Nature Chemical Biology, doi:10.1038/nchembio.496

Neutrophile Granulozyten wehren eindringende Mikroorganismen nicht nur durch Phagozytose ab. Wie die Gruppe von Arturo Zychlinski 2004 zeigen konnte, werfen die durch ein spezifisches Zelltodprogramm (NETose) absterbenden Immunzellen – abhängig von NADPH-Oxidase-Aktivität – eine aus nukleärer DNA, Histonen und antibakteriellen Proteinen bestehende netzartige Struktur aus, die Patho gene abtötet, aber auch zu Autoimmunkrankheiten und Entzündungen beitragen kann – sogenannte neutrophil extracellular traps (NETs). Welche molekularen Mechanismen zur NET-Bildung führen, lag wegen der kurzen Lebenszeit der Granulozyten bislang außerhalb der Reichweite experimenteller Methoden. Mit einem zellbasierten Assay, der durch Inkorporation des DNA-interkalierenden Farbstoffes Sytox Green tote von lebenden Neutrophilen unterscheidet, sowie automatisierter Mikroskopie, die vier Stadien der NET-Bildung anhand der Zellkernfläche und -morphologie (lobuliert/delobuliert/diffus/ausgebreitet) differenziert, führten die Gruppen um Arturo Zychlinski vom MPI für Infektionsbiologie und Herbert Waldmann vom Dortmunder MPI für molekulare Physiologie einen Screen auf Inhibitoren der frühen und späten NET-Bildung durch. Dabei entdeckten sie drei bislang unbekannte Inhibitoren (der c-RAF-Kinase, von MEK und ERK2) der frühen NET-Bildung, die eine Beteiligung des upstream von der NADPH-Oxidase-Aktivität gelegenen RAF-MEK-ERK-Signalweges nahelegen, der via Überexpression des antiapoptotischen Proteins Mcl-1 zudem die Apoptose zugunsten der NETose abzuschalten scheint.

gewählt, um Inhibitoren der NET-Bildung zu identifizieren.

LABORWELT:Was sind die wichtigsten Resultate des Screens, den Sie durchgeführt haben?

ZychlinskiZunächst: Der von Abdul Hakkim und Tobias Fuchs entwickelte zellbasierte Assay lieferte uns zwei Readouts. Er gestattete es uns, defi-nierte Stadien des Prozesses der NET-Bildung zu unterscheiden und in diesen Stadien Subs-tanzen zu identifizieren, die die NET-Bildung inhibieren. Mit diesem leistungsfähigen Test-system haben wir einen kleinen Screen mit ungefähr 600 Substanzen durchgeführt.

In Neutrophilen, in denen wir die NET-Bildung in Anwesenheit von Inhibitoren auf verschiedene Weise induziert hatten, entdeckten wir, dass die RAF-MEK-ERK-Sig-nalkette wichtig für die Bildung der NETs ist. Das war zuvor nicht bekannt. Zudem fanden wir Hinweise, dass über diesen Weg auch das antiapoptotische Protein Mcl-1 hochreguliert wird, was nahelegt, dass der Raf-Mek-Erk-Pathway die Apoptose unterbindet, damit das NET-spezifische Zelltod-Programm Netose ablaufen kann.

Der RAF-MEK-ERK-Pathway steuert viele biologische Prozesse. Um NET-spezifische In-

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Wissenschaft Tumorzellnachweis

Hochsensitiver Nachweis von Tumorzellen mittels Amplikon-Fusion-Site-PCR Axel Weber und Holger Christiansen, Abteilung für Kinderhämatologie, -hämostaseologie und -onkologie der Universitätskinderklinik Leipzig

Hochsensitive Verfahren zum direkten Nachweis von Tumorzellen und tumorzellspezifischen Veränderungen auf Genom- (DNA) oder Genexpressions(mRNA)-Ebene halten zunehmend Einzug in die klinische Praxis. Aktuell sind zytologische und molekulargenetische, insbesondere PCR-basierte Methoden, wichtige diagnostische Bausteine im Rahmen der Untersuchung auf das Vorliegen einer minimalen Resterkrankung (Minimal residual disease = MRD) hämatologi-scher Malignome geworden, vor allem bei der akuten lymphatischen Leukämie (ALL). Mit den entsprechenden Verfahren lassen sich geringste Mengen von Tumorzellen im Knochenmark, peripherem Blut oder auch anderen Geweben und Körperkompartimenten (z.B. Lymphknoten, Metastasen, Liquor, Urin etc.) nachweisen. In zunehmendem Maße wird die MRD-Diagnostik auch zur Beurteilung des Remissionsstatus verschiedener solider Tumore genutzt. Ein Weg, Tumorzellen beziehungsweise deren Genom mit absoluter Spezifität und hoher Sensitivität zu detektieren und zu quantifizieren, bietet die Amplikon-Fusions-Stellen-PCR (AFS-PCR). Dieses Verfahren, das wir in der aktuellen Ausgabe des Journal of Clinical Investigation (2011;121(2):545-553. doi:10.1172/JCI44415)1 vorstellen, detektiert spezifische Fusionsbereiche zwischen Einzelko-pien amplifizierter Genomabschnitte (ampGA).

immer die Auswertbarkeit und die klinische Relevanz der erhobenen Daten berücksichtigt werden.

Methoden der MRD-Diagnostik

Die Ansprüche an eine möglichst optimale MRD-Diagnostik sind: I eine möglichst absolute Tumorzellspezi-

fität, I eine möglichst hohe Sensitivität und I eine möglichst valide Möglichkeit zur ab-

soluten oder zumindest relativen Quanti-fizierung der Tumorzelllast.

Derzeit findet vor allem die Durchflusszyto-metrie (FACS-Analyse) als Nachweismethode residueller maligner Blasten in der Leukämie-diagnostik breite Anwendung 2,3. Daneben ha-ben sich verschiedene PCR-basierte Verfahren zur Detektion von Malignomzellen etabliert: I Die klonspezifische PCR in Rearrangement-

bereichen von Genen, die für Immunglobu-linketten (IgH, TCR, etc.) kodieren (Nachweis auf DNA-Ebene)4-6. Diese Methode ist per definitionem nur für Leukämieerkrankun-gen sinnvoll einsetzbar, denn nur in diesen können die genomischen Rearrangements gefunden werden.

I PCRs, die über einen Fusionsbereich spezifi-scher Translokations-Fusionstranskripte (z.B. BCR/ABL, Tel/AML1) gelegt werden7,8. Der Nachweis von Fusionstranskripten ist in den meisten Fällen Tumorzell-spezifisch. Aller-dings findet der Nachweis auf mRNA-Ebene

Der Nachweis und die Quantifizierung gerings-ter Mengen an Tumorzellen in Knochenmark, peripherem Blut oder Geweben bzw. Körper-kompartimenten (Lymphknoten, Metastasen, Liquor, Urin etc.) im Verlauf onkologischer Erkrankungen kann eine wichtige Aussage über das Therapieansprechen der Erkrankung geben, zum Beispiel nach den ersten Thera-pieelementen (Operation, Chemotherapie, Bestrahlung). Die Diagnostik auf das Vorlie-gen einer minimalen Resterkrankung (MRD) entspricht einem in vivo-Assay der jeweiligen Malignome bezüglich der individuellen The-rapiesensibilität und -effektivität. Derzeit werden Informationen über eine MRD bereits routinemäßig zu festgesetzten Zeitpunk-ten der Therapie im Rahmen verschiedener Leukämieformen eingesetzt und dienen hier teilweise auch als unabhängige Prognose- und Stratifizierungsparameter1–5. Der Einsatz der MRD-Diagnostik zur Beurteilung des Remis-sionsstatus verschiedener solider Tumore ist aktuell Gegenstand intensiver Forschung. Eine weitere, potentielle Anwendungsmöglichkeit hochsensitiver MRD-Verfahren ist der Nach-weis minimaler Mengen von Malignomzellen in Stammzell- oder Knochenmarkpräparaten, die für eine eventuelle autologe Transplanta-tion/Retransfusion des jeweiligen Patienten genutzt werden könnten. Neben den metho-dischen Herausforderungen müssen hier auch

Abb. 1: Entwicklung einer Tumorzell- spezifischen und Patienten- individuellen AFS-PCR

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statt. Die verglichen mit genomischer DNA wesentlich höhere Instabilität der mRNA kann direkten Einfluss auf eine robuste und valide quantifizierbare MRD-Diagnostik haben.

I PCRs für „Tumorzell-spezifische“ Genexpres-sionsmuster9,10. Die Spezifität der Expression einzelner oder mehrerer Gene für Tumorzel-len kann im Verlauf allerdings nur bedingt garantiert werden, denn durch die in den The-rapieschemata eingesetzten Medikamente sind theoretisch alle im Körper befindlichen Zellen in ihrer Genexpression beeinflussbar. Eine valide Quantifizierung kann somit auch hier nicht sichergestellt werden.

I PCRs, die die genomischen Veränderungen (Amplifikationen, Deletionen, Translokati-onen, Punktmutationen) auf DNA-Ebene nachweisen11 Bei Translokationen und Punkt-mutationen stellt das Auffinden der betrof-fenen, spezifisch veränderten Sequenzen ein Hauptproblem dar. Dieses kann technisch sehr aufwendig und dadurch für den

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Wissenschaft Tumorzellnachweis

Abb. 2: Spezifische AFS-Fragmente können in Knochenmark (KM), Blutproben (pB) und Rezidivgewebe (R) von Neuroblastompatienten nachgewiesen werden. A. Der Tumorzell-Gehalt in den Primärtumoren wurde vereinfachend als 1.0 (100%) an-gesetzt. Der Tumorzell-Gehalt der Folgeproben wurde mittels der 2-ΔΔCt-Methode berechnet. Als Kontrolle (Kontr.) diente humane Plazenta-DNA. B. Realtime-PCR- Kurven der entsprechenden Untersuchungen. Die Probenbezeichnung (TU20, 21 und 23) entspricht der Probennummer der Gesamtuntersuchungsgruppe (n=40).

Einsatz in der Praxisroutine uninteressant sein. Einen großen Vorteil „numerischer“ Aberrationen stellt die Möglichkeit dar, diese über Arrayverfahren hochauflösend darstellen zu können. Über Gesamtgenom-Arrays kann nach diesen in fast allen Ma-lignomen vorkommenden Veränderungen „gescreent“ werden. Sind Amplifikationen oder Deletionen gefunden, können diese über hochauflösende, genomische Tiling-Arrays genau abgegrenzt werden und bieten damit weitere Möglichkeiten zur Etablierung Tumorzell-spezifischer PCR-Assays1.

AFS-PCR als alternative MRD-Diagnostik

Beispielhaft konnten wir für Patienten mit MYCN-amplifizierten Neuroblastomen ein Verfahren entwickeln, bei dem spezifische Fusionsbereiche (Amplikon-Fusions-Stellen, AFS) zwischen einzelnen Kopien amplifizierter Genomabschnitte (ampGA) nachgewiesen und für die Entwicklung einer sensitiven PCR genutzt werden. Ein Schema des Un-

tersuchungsablaufes ist in Abbildung 1 dar-gestellt.

Um die Grenzen der amplifizierten Genom-abschnitte genau identifizieren zu können, wurde genomische DNA von (n=40) primären Neuroblastomen und (n=3) Neuroblastom-Zelllinien mit bekannter MYCN-Amplifikation mittels eines hochauflösenden Tiling-Arrays (HR-TA) untersucht. Aufgrund der Fokussierung der Untersuchung auf einen etwa 20 Mega-basen großen Bereich auf dem kurzen Arm von Chromosom 2 konnten die auf den Array hybridisierten DNA-Oligonukleotide in einem durchschnittlichen Abstand von 50 (± 8bp) Basen designt werden. Bereiche mit hoher Re-peatdichte sind hiervon ausgenommen. Dabei zeigten sich die Ausdehnung der amplifizierten Genomabschnitte und damit deren telomer- und centromerseitigen Grenzen als individuelle Eigenschaften jedes einzelnen untersuchten Neuroblastom-Genoms. Wir konnten MYCN-Amplikons darstellen, die aus nur einem am-plifizierten Genomabschnitt (Typ-1) bestehen und solche, die aus mehreren amplifizierten Genomabschnitten (ampGA) aufgebaut sind (Typ-2). Durch vergleichende Untersuchungen der genomischen DNA aus Primärtumoren und

den dazugehörigen residualen Tumoren nach Therapiebeginn bzw. Rezidiven (n=3) konnte eine absolute Konstanz der Grenzen der am-plifizierten Genomabschnitte in diesen Fällen nachgewiesen werden.

Die telomer- und centromerseitigen ampGA-Grenzen konnten anschließend in 37 von n=43 untersuchten Amplikons mittels PCR validiert werden. Die resultierenden PCR-Assays stellen die Grundlage für die MRD-Diagnostik dar.

Im Falle der Typ-1-Amplikons werden hierzu jeweils die ersten und letzten 1.000 Basen des auf dem Array als amplifizierten Genom-abschnittes dargestellten Bereiches virtuell fusioniert und damit so aneinandergereiht, dass jeweils auf das Ende eines amplifizierten Genomabschnittes der Anfang des nächsten ampGA folgt. Auf diese Weise wird der Fusions-bereich nachgestellt, in dem – in gleichgerich-teter Orientierung – die amplifizierte Sequenz wieder aufeinander folgt. Dieser simulierte Fusionsbereich dient zum Primerdesign für die nachfolgenden AFS-PCR-Reaktionen. Die Primer werden so designt, dass jeweils ein Primer im telomerseitigen und ein Primer im centromer-seitigen Sequenzbereich des amplifizierten Genomabschnittes liegt. Eine PCR kann also nur zu einem Produkt führen, wenn diese Bereiche wirklich aneinander fusioniert sind.

Liegt ein Typ-2-Amplikon vor, bietet die Überbrückung nicht-amplifizierter Bereiche, die auf der Arraydarstellung wie Lücken innerhalb eines amplifizierten Genomabschnittes wirken, eine weitere Möglichkeit, eine Malignomzell-spezifische AFS-PCR zu designen. Die einzelnen amplifizierten Genomabschnitte können dabei in gleicher oder in inverser Richtung miteinan-der fusioniert gefunden werden. Das bedeutet, dass zwei aufeinanderfolgende amplifizierten Genomabschnitte innerhalb des Amplikons so angeordnet sein können, dass an ampGA-1 in „Telomer → Centromer“-Ausrichtung der nächste ampGA-2 in „Centromer → Telomer“-Ausrichtung fusioniert ist.

Wir konnten einzelne, amplifizierte Genom-abschnitte in einer Entfernung von mehr als 50 Megabasen zu MYCN identifizieren, die in die Amplikon struktur integriert und damit einer AFS-PCR zugänglich waren. Die Lokalisation, die Ausdehnung und der genomische „Inhalt“ des amplifizierten Bereiches sind für die Etablierung einer AFS-PCR unerheblich.

Durch Sequenzierung der PCR-Fragmente, die die Amplikon-Fusions-Stellen beinhalteten, können die Grenzen der amplifizierten Genom-abschnitte letztlich basengenau beschrieben werden. Die exakte Sequenz ermöglicht das Design von PCR-Primern, die in einem realtime-PCR-Assay eingesetzt werden können. In unse-rer Untersuchung wurden alle realtime-PCRs als SYBR-Green-Assays etabliert, um die Spezifität des PCR-Produktes mittels anschließender Schmelzkurvenanalyse überprüfen zu können.

Wird die AFS-DNA in den Primärtumoren auf ein Kontrollgen normalisiert, das nicht amplifiziert vorliegt, lässt sich die AFS-DNA in


LABORWELT

den Verlaufsproben relativ quantifizieren. Ist der Tumorzellgehalt des Primärtumors bekannt und kennt man zum Beispiel die Leukozyten-zahl der im Verlauf entnommenen Blutprobe, ermöglicht dies die Bestimmung der exakten Anzahl der Tumorzellen oder Tumorzellgenome in der untersuchten Probe. Die Berechnung erfolgt dabei analog zur 2-ΔΔCt-Methode, die bei Genexpressionsanalysen mittels realtime-PCR verwendet wird.

Sensitivität und klinische Relevanz

Um die Sensitivität des Verfahrens auszu-testen, wurden von den drei untersuchten Neuroblastom-Zelllinien Verdünnungsreihen mit einer nicht-MYCN-amplifizierten Kontroll-zelllinie hergestellt. In diesen Zellverdünnungs-experimenten konnten wir mittels AFS-PCR eine Tumorzelle in einem Hintergrund von 106-107 Kontrollzellen detektieren.

Um die klinische Anwendbarkeit des Ver-fahrens zu zeigen, untersuchten wir DNA aus Knochenmark und peripherem Blut verschiede-ner Patienten mit MYCN-amplifizierten Neuro-blastomen (Abb. 2) zum Zeitpunkt der Diagnose sowie im weiteren Verlauf. In den untersuchten Proben konnte die AFS-DNA in verschiedenen Konzentrationen nachgewiesen werden.

Die Individualität der Grenzbereiche der amplifizierten Genomabschnitte, die einfa-che Etablierung einer spezifischen PCR über einen AFS-Bereich und die Konstanz der amplifizierten Genomabschnitte im Verlauf der Erkrankung prädestinieren die AFS-PCR für den Einsatz in der klinischen Diagnostik, insbesondere für den hochsensitiven Nachweis von Tumorzellen bzw. Tumorzell-DNA im Sinne einer MRD-Diagnostik.

Das Verfahren wurde beispielhaft an MYCN-amplifizierten Neuroblastomen entwickelt. Die potentielle Übertragbarkeit auf andere amplifizierte Genomabschnitte eröffnet aber die Möglichkeit, diese Methode auch für viele andere Tumorentitäten als Diagnosti kum einzusetzen. Das Verfahren ließ sich in un-serem Labor auch erfolgreich auf deletierte genomische Abschnitte und die resultierenden Fusionsbereiche übertragen. Aktuelle Studien gehen davon aus, dass in fast jedem Malig-nom strukturelle, numerische Aberrationen vorliegen 12,13. Die Wertigkeit eines Nachweises geringster Mengen von Tumorzellen bzw. Tu-morzellgenom sollte für jede Malignomentität studienbegleitend überprüft werden.

Eine hohe Auflösung des Tiling-Arrays (≤ 200bp) ist wichtig, um anschließend die Primer für die weiteren Untersuchungsschritte mit zufriedenstellender Sicherheit designen zu können. Glücklicherweise erreichen genomische Arrays immer höhere Auflösungen und werden immer erschwinglicher, so dass diese Methode in näherer Zukunft eine breitere Anwendung finden und eine Alternative zu herkömmlichen MRD-Verfahren darstellen könnte. Neben den

verbreiteten Arrayplattformen sind die immer mehr in die Forschung Einzug haltenden Next-Generation-Sequencing-Verfahren prädesti-niert, Tumorzell-spezifische Aberrationen zu identifizieren und den „Umweg“ über das se-parate Sequenzieren einzelner PCR-Produkte zu ersparen. Aufgrund des zeitlichen, technischen und nicht zuletzt pekuniären Aufwandes dieser Methoden sind diese für die Anwendung in der Routine jedoch derzeit noch ungeeignet.

Literatur

[1] Weber et al.; Detection of human tumor cells by amplicon fusion site polymerase chain reaction (AFS-PCR); J Clin Invest. 2011;121(2):545–553. doi:10.1172/JCI44415

[2] Dworzak MN, et al.; Detection of residual disease in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia by comparative phenotype mapping: a study of five cases controlled by genetic methods; Exp Hematol. (1999) Apr;27(4):673-81.

[3] Dworzak MN, et al.; Standardization of flow cytometric minimal residual disease evaluation in acute lymphoblastic leukemia: Multicentric assessment is feasible; Cytometry B Clin Cytom. (2008) Nov;74(6):331-40.

[4] van Dongen JJ and Wolvers-Tettero IL.; Analysis of immuno-globulin and T cell receptor genes. Part I: Basic and technical aspects; Clin Chim Acta. (1991) Apr;198(1-2):1-91.

[5] van Dongen JJ and Wolvers-Tettero IL.; Analysis of immuno-globulin and T cell receptor genes. Part II: Possibilities and limitations in the diagnosis and management of lymphoproli-ferative diseases and related disorders. Clin Chim Acta. (1991) Apr;198(1-2):93-174.

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Korrespondenzadresse

Dr. med. Axel WeberAbt. für Kinder-Hämatologie, -Onkologie und -Hämostaseologie – Universitätsklinik und Poliklinik für Kinder und Jugendliche – Zentrum für Frauen- und KindermedizinLiebigstraße 20a04103 LeipzigTel.: +49-(0)[email protected]@medizin.uni-leipzig.dewww.neuroblastom.info

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Verbesserte zellbasierte siRNA-Screens im hohen DurchsatzKristin Hille, Constanze Grunau, Christiane Petzold, Jan Zimmermann, Jacques Rohayem, Riboxx GmbH, Radebeul

Zellbasierte Studien zur Genotyp-Phänotyp-Assoziation sind Gegenstand verschiedener Forschungsansätze zur Charakterisierung der Mechanismen von Erkrankungen. Das gezielte Ausschalten der Expression von Proteinen in Säugerzellen und Geweben durch Gene Silenci-ng bzw. dessen Spezialfall RNA-Interferenz ist dabei ein häufig eingesetzter experimenteller Ansatz. Zur mRNA-Sequenz komplementäre, kurze (19-32 Nukleotide), doppelsträngige siRNA-Moleküle (small interfering RNA) leiten dabei den gezielten Abbau des entsprechen-den Transkriptes ein – mit entsprechenden Auswirkungen auf die nachfolgende Proteinex-pression und den Zell- und Gewebephänotyp. Der in der Theorie vielversprechende Ansatz, die Auswirkungen der Expression einzelner Gene auf den Phänotyp mittels RNA-Interferenz zu analysieren, ist in der Praxis jedoch durch die mangelnde Stabilität und Spezifität der siRNAs sowie ihre teure Herstellung oft mit Problemen behaftet. Die von uns entwickelte und hier vorgestellte Riboxx-Technologie adressiert diese Probleme.

bestimmt ihr Schicksal in der Zelle, also über welchen intrazellulären Weg (Pathway) sie prozessiert werden: I Die Verabreichung von siRNA bis zu einer

Länge von bis zu 27 Nukleotiden ermöglicht die direkte Beladung der Moleküle in einen Enzymkomplex namens RISC (RNA interfe-rence silencing complex). Der RISC besteht aus verschiedenen zellulären Enzymen, die zur Auftrennung der doppelsträngigen

RNA, aber auch zum Abbau der Ziel-mRNA führen. Der Abbau erfolgt mit Hilfe der als Ribonuclease wirkenden Argonauten-Proteine1, die an der Position 10 des guide strands bzw. der Ziel-mRNA zur Spaltung führen. Durch die spezifische Hybridisie-rung des guide strands an die mRNA ist der Abbau des Target-Moleküls gegeben.

I Nach Verabreichen von längeren, doppel-strängigen RNAs von 28 bis 32 Nukleotiden in die Säugerzelle gelangen diese in den DICER-Komplex. Der DICER-Komplex prozes-siert die doppelsträngigen RNA- Moleküle zu kleineren Molekülen mit einer Länge von 21 bis 22 Nukleotiden2. Dabei werden die Enden des doppelsträngigen RNA-Moleküls jeweils mit Überhängen am 3‘-Ende der Einzelsträn-ge versehen. Diese Überhänge können zwei bis drei Nukleotide lang sein.

Das Verabreichen der siRNA-Moleküle erfolgt mit Hilfe verschiedener Zellverabreichungs-systeme wie etwa liposombasierten Reagen-zien, Nanopartikeln, mechanischen Reizströ-men (Elektroporation) oder durch Ankoppeln des doppelsträngigen RNA-Moleküls an Cho-lesteringruppen. Für in vitro-Experimente ist die Technologie zur Verabreichung von siRNAs fortgeschritten und führt zu zufriedenstellen-den Ergebnissen.

Die Spezifität der siRNA wird insbesondere durch die Hybridisierung der sogenannten seed-Sequenz an die Target-mRNA bestimmt. Die seed-Sequenz befindet sich zwischen Po-sition zwei und acht des guide strands.

siRNAs bestehen aus zwei einzelsträngigen RNA-Molekülen mit einer Länge von 19 bis 30 Nukleotiden. Die zueinander sequenzkom-plementären RNA-Einzelstränge werden als „sense“ oder „passenger strand“ sowie als „antisense“ oder „guide strand“ bezeichnet. Der passenger strand ist mit der Zielsequenz in der mRNA identisch, der guide strand ist zur Zielsequenz beziehungsweise zum sense strand komplementär. Die Länge der siRNAs

Abb. 1: A. Strukturelle Eigenschaften der riboxx® siRNA. Die riboxx® siRNA ist 24 Nukleotide lang und besitzt das sogenannte riboxx® Sequenzmotiv. Im Vergleich zur geläufigen siRNA mit 3‘-Überhängen ist die riboxx® siRNA eine Blunt-End-siRNA und hat dem-entsprechend keine Überhänge am 3‘-Ende der sense- oder antisense-RNA. B. Erhöhte Stabilität der riboxx® siRNA im Vergleich zur herkömmlichen siRNA mit 3‘-Überhängen. Die riboxx® siRNA und die herkömmliche siRNA mit 3‘-Überhängen wurden in 80%-igem Mausserum inkubiert (3 µM) und nach 4h, 24h, 48h und 72h mittels nativer PAGE analysiert. Herkömmliche siRNA mit 3‘-Überhängen wurde vollständig abgebaut und war nach 48h nicht mehr detektierbar. Im Vergleich dazu erwies sich die riboxx® siRNA als bis zu 72h stabil.

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Probleme der RNA-Interferenz durch siRNA

Mit zunehmendem Wissen über die Mechanismen der RNA-Interfe-renz wurden in den vergangenen Jahren zahlreiche Untersuchungen zur Spezifität der Prozessierung der Ziel-mRNA veröffentlicht. Es wird heute in der Life Science Community erkannt, dass die Spezifität des Gene silencings durch siRNA nicht immer in der erwünschten Weise gegeben ist. Es kommt zum Beispiel zu sogenannten off-target-Effekten, die sich darauf zurückführen lassen, dass auch andere Sequenzen als die der Ziel-mRNA-Sequenz prozessiert wer-den. Da dies nicht ohne Wirkung auf den Phänotyp der Zelle bleibt, wird die Genotyp-Phänotyp-Assoziation verfälscht. Die off-target-Effekte bilden eines der größten Probleme der RNA-Interferenz durch siRNA im Rahmen von Hochdurchsatz- oder High-throughput-Screens (HTS).

Ein zusätzliches Problem betrifft die Stabilität der siRNA sowohl in dem zu verabreichenden Medium als auch nach Aufnahme in die Zelle im Zytoplasma. Hier werden verschiedene zelluläre Mechanismen eingeschaltet, die den Abbau der siRNA bewirken. Dieses Problem stellt eine zweite Hürde bei der Durchführung der siRNA-Experimente dar, denn erwünscht ist, ein Gene silencing mit einer Zeitdauer von Tagen bis Wochen zu erzielen, insbesondere bei primären Säugerzellen.

Ein drittes Problem betrifft die Herstellung der siRNA-Moleküle. Dadurch, dass die HTS-siRNA oft auf das gesamte Genom einer Säu-gerzelle zielt (genome wide HTS), werden sogenannte „libraries“ oder siRNA-Bibliotheken generiert. Diese siRNA-Bibliotheken beinhalten bis zu mehrere 10.000 siRNA-Moleküle, die in hohem Durchsatz in zellbasierten Assays eingesetzt werden. Die Herstellungskosten solcher Moleküle stellen eine wirtschaftliche Hürde dar, die den Zugang zu dieser Technologie auf hochspezialisierte Einrichtungen mit den entsprechenden Budgets beschränkt. Darüber hinaus steht ein technologisches Problem im Zentrum dieses Produktionsverfah-rens. Die Herstellung von doppelsträngiger RNA erfolgt bis dato auf Basis der Festphasensynthese. Dabei werden zwei doppelsträngige RNAs – der guide strand und der passenger strand – synthetisiert, aufgereinigt, analysiert und in einem weiteren Schritt zu einem Duplex zusammengeführt.

Die Qualität des Duplexes wird in der Regel bei allen herkömm-lichen siRNA-Bibliotheken nicht verifiziert. Dadurch bleibt es un-klar, ob die Hybridisierung von guide- und passenger strand mit 100-prozentiger Effizienz stattgefunden hat. Weitere Probleme der Hydrolyse von Duplexen bzw. verbleibenden Einzelsträngen sind bei den herkömmlichen siRNA-Bibliotheken nicht erfasst. Dies führt zu sehr schwankenden Ergebnissen beim Gene Silencing im Rahmen der High-throughput-Screens von siRNA-Bibliotheken.

Die riboxx®-siRNA: Hochpotente und serumstabile siRNA

Die Riboxx-Technologie zielt darauf ab, diese geschilderten Probleme zu vermindern, also die Stabilität der siRNA zu erhöhen, die die Effizi-enz der siRNA zu steigern und die Qualität der siRNA-Duplexe durch perfekte Hybridisierung der beiden RNA-Stränge zu verbessern. Die erhöhte Potenz und erhöhte Stabilität der riboxx® siRNA lassen sich auf das riboxx® Sequenzmotiv zurückführen (Abb. 1A).

Dieses besteht aus einer G/C-Sequenz, die sich auf der Seite befin-det, die der seed-Sequenz gegenüber liegt. Im Gegensatz zu den geläu-figen siRNA Design-Motiven hat die riboxx® siRNA keine Überhänge. Da sie 24 Nukleotide lang ist, wird sie direkt auf dem RISC-Komplex beladen. Die GC-reiche Sequenz führt zu einer thermodynamischen Instabilität in der siRNA. Diese thermodynamische Instabilität drückt sich wiederum durch eine präferenzielle Beladung des guide strands auf dem RISC-Komplex im Vergleich zum passenger strand

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aus. Dadurch, dass der guide strand die ent-scheidende Rolle sowohl bei der Erkennung der Ziel-mRNA als auch ihrer Prozessierung durch das Argonauten-Protein spielt, wird viel weniger siRNA für ein effizientes Gene silencing benötigt als beim Einsatz von siRNA mit herkömmlichen Sequenzmotiven3.

Darüber hinaus erhöht das riboxx® Se-quenzmotiv die Serumstabilität der siRNA. (Abb. 1B). Mit der höheren Serumstabilität der siRNA geht eine verbesserte Effizienz des Gene Silencings einher, was wiederum bewirkt, dass die für das Gene Silencing be-nötigte siRNA-Konzentration viel niedriger ist als bei Einsatz von siRNA mit herkömm-lichen Sequenzmotiven. Dies führt auch zu einer Verringerung der off-target-Effekte. Damit eröffnet die Riboxx-Technologie die Beseitigung von off-target-Effekten sowie die Verlängerung der Dauer des Gene Silen-cings.

Einfache, schnelle und kosteneffiziente Herstellung durch Biokatalyse

Auch die bisherigen Probleme bei der Her-stellung von siRNA-Bibliotheken – hohe Kosten, großer Herstellungsaufwand sowie mangelnde Qualitätssicherung der siRNA-Duplexe – lassen sich durch Einsatz der Riboxx-Technologie anstelle der Festphasen-synthese lösen. Das von Riboxx entwickelte Herstellungsverfahren basiert auf der bioka-talytischen Synthese von RNA mit Hilfe einer

Abb. 2: Einfache, schnelle und kosteneffiziente Herstellung von siRNA mit Hilfe der Riboxx-Technologie. A. Synthese von siRNA durch Bio-katalyse. Ausgehend von einer einzelsträngigen RNA synthetisiert die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RNA-dependent RNA Po-lymerase, RdRp) unter isothermen Bedingungen (30°C, 120 min) eine siRNA, die aus zwei perfekt hybridisierten RNAs besteht. Die Reaktion erfolgt in der Anwesenheit von Puffern und Ribonukleotiden. B. Herstellung von HTS-siRNA mit der Riboxx-Technologie. Der Herstellungsprozess beinhaltet drei Schritte: Die Synthese von siRNA im 96 well-Format, die Aufreinigung durch Size exclusi-on-Chromatographie (SEC) und die Analyse mittels HPLC und Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

A B

RNA-abhängigen RNA-Polymerase, die hete-rolog in E. coli hergestellt wird. Das Enzym ist viraler Herkunft und bietet die Möglichkeit der de novo -Initiation, also der Primer-unabhängigen Initiation der RNA-Synthese, und der Umwandlung von einzelsträngiger in doppelsträngige RNA. Die Reaktion erfolgt isotherm bei 30°C und führt zu zwei perfekt hybridisierten RNAs (Abb. 2A).

Die resultierende, perfekt hybridisierte siRNA besitzt zudem das riboxx® Sequenz-motiv. Die biokatalytische Synthese von siR-NA ermöglicht es, den Herstellungsprozess von siRNA-Bibliotheken maßgeschneidert für jede Einrichtung anzubieten. Der Herstel-lungsprozess selbst beinhaltet drei Schritte (Abb. 2B):

I die Synthese der siRNA im 96 well-Format durch Biokatalyse,

I die Aufreinigung durch Größenausschluss-chromatographie und

I die anschließende Analyse mittels HPLC und Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Diese Schritte dauern fünf Tage und sind auto-matisierbar. Die Herstellungskosten reduzieren sich durch das Anwenden der Biokatalyse drastisch, denn die Riboxx-Technologie benö-tigt für die Herstellung der doppelsträngigen siRNA lediglich den guide strand als Template, Ribonukleotide sowie Puffer als Reagenz. Die Festphasenchemie benötigt dagegen Amidite, die die Material- und Herstellungskosten um ein Vielfaches erhöhen.

Zusammenfassung und Ausblick

Durch die Einführung einer neuen Technologie zur Herstellung von siRNA-Bibliotheken aber auch durch die Erhöhung der Stabilität und der Potenz von siRNAs kann die Riboxx-Technologie erheblich zur Verbreitung der Verwendung von siRNA screens von HTS-siRNA beitragen. Die größten Vorteile der Riboxx-Technologie liegen im zuverlässigen und potenten Gene Silencing sowie in der Reduktion der Herstellungs- und Materialkosten für solche Libraries. Damit wird der Weg zur breiten Anwendung von HTS-siRNA in Forschungseinrichtungen geebnet.

Literatur

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[3] Zieger R, Gebhardt J, Rohayem J. Effizientes Gene Silenc-ing durch potente und serumstabile siRNA. Biospektrum. 2010. 7:782-85


Dr. med. habil. Jaques RohayemGeschäftsführer (CEO)Riboxx GmbHPharmapark RadebeulMeissnerstraße 191, 01445 Radebeulwww.riboxx.com


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Blitzlicht Gene Silencing

Nur wenige Jahre nach der Entdeckung der RNA-Interferenz (RNAi)1 als universellem Mechanismus der posttranskriptionellen

Regulation der Genexpression in Eukaryoten hat sich RNAi als wichtiges Werkzeug in der pharmazeutischen Forschung etabliert. Es be-

steht zudem die Hoffnung, neue Medikamente auf RNAi-Basis zu entwickeln, die sowohl eine hohe Spezifizität als auch geringe Nebenwir-kungen aufweisen. Unter den Wegen, RNAi in Zellen auszulösen, stehen zwei Arten von kleinen, nicht-kodierenden Ribonukleinsäuren im Zentrum der Aufmerksamkeit – die „small interfering RNAs“ (siRNAs) und microRNAs (miRNAs).

siRNAs geraten auf natürlichem Wege häufig von außen in Säugetierzellen, zum Bei-spiel durch Viren. Die virale, doppelsträngige RNA wird im Zytoplasma vom Enzym DICER zu kurzen Fragmenten von 21 bis 23 Nukleo-tiden geschnitten. Ein Strang dieser siRNA, der Leitstrang, wird in einen Enzymkomplex geladen, den „RNA Induced Silencing Com-plex“ (RISC), wo er die enzymatische Spaltung der komplementären Boten-RNA (mRNA) katalysiert. Die Spaltung der mRNA erfolgt gegenüberliegend der Nukleinsäuren 10 und 11 der siRNA und ist sehr sequenzspezifisch, vollständige Komplementarität ist im Allge-meinen notwendig.

Die zellkernkodierten miRNAs nutzen nach Prozessierung und Zellkernexport im Prinzip die gleiche Zell-Maschinerie wie siRNAs, bin-den aber an die nicht-exprimierten Regionen

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Abb. 1: (A) RONDEL-Komponenten zur Formulierung von siRNA zu Nanopartikeln mit oberflächengebundenen Liganden. Die Komponenten sind: Ein kationisches, lineares Polymer mit β-Cyclodextrin-Blöcken (CDP), ein Adamantan-PEG-Konjugat (AD-PEG) und ein Adamantan-PEG-Ligand, in welchem der Ligand aus Transferrin-Protein besteht (AD-PEG-Tf). (B) Funktionsweise der RONDEL-Nanopartikel: Die Nanopar-tikel zirkulieren im Blutsystem des Patienten, von wo aus sie über die undichten Blutgefäße der Tumoren entweichen. Die Nanopartikel diffundieren durch das Tumorgewebe, binden an Transferrin-Rezeptoren auf Tumorzellen und werden durch Endozytose aufgenommen. Ansäuerung der Endosomen führt zur intrazellulären Freisetzung der therapeutischen siRNA.

RNA-Interferenz macht den Sprung vom Labor zum MenschenThomas Schluep, CSO, Calando Pharmaceuticals, Pasadena, CA, USA

RNA-Interferenz ist ein universeller Mechanismus, durch den die Herstellung jedes beliebigen Ziel-proteins durch siRNA-induzierten posttranslationalen Abbau seiner Boten-RNA unterdrückt werden kann. Einer verbreiteten therapeutischen Anwendung stehen jedoch die schlechten pharmakolo-gischen Eigenschaften der aktiven siRNA (small interfering RNA) im Wege. Der Transport der thera-peutschen Nukleinsäuren zu den Zielzellen ist eines wichtigsten Probleme der therapeutischen RNAi. Hier wird die Entwicklung des ersten experimentellen Therapeutikums beschrieben, das den zielge-richteten Transport von siRNA im Menschen ermöglicht. Die Nanopartikel-Formulierung CALAA-01 besteht aus Polymeren auf Zyklodextrin-Basis, einem PEG-Konjugat zur Erhöhung der Stabilität und Transferrin-Liganden, die die Bindung an Transferrin-Rezeptoren auf Krebszellen ermöglichen. Die Eigenschaften von CALAA-01, präklinische und erste klinische Resultate werden besprochen.

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am 3‘-Ende der mRNA und regulieren über de-ren Abbau ganze Gen-Netzwerke und Systeme, um biologische Funktionen zu steuern.

Die Möglichkeit, die Herstellung jedes uner-wünschten Proteins quasi einschränkungslos und mit hoher Spezifizität zu unterdrücken, hat auch das Interesse der Pharma-Industrie ge-weckt. Denn mit herkömmlichen Medikamen-ten ist dies oft nur sehr schwer zu erreichen. Leider besitzen Nukleinsäuren jedoch denkbar schlechte pharmakologische Eigenschaften. Zum einen sind sie extrazellulär instabil und werden schnell abgebaut oder über die Nieren ausgeschieden. Zum andern werden sie nur schlecht von Zellen aufgenommen, so dass unmodifizierte siRNA hauptsächlich zur loka-len Therapie zum Beispiel im Auge verwendet wird. Der Transport der therapeutischen Nu-kleinsäuren zu den Zielzellen ist somit eines der wichtigsten Probleme der therapeutischen RNA-Interferenz.

Das Problem, Nukleinsäuren in Zellen zu schleusen, ist nicht neu, und es gibt unzählige Lösungsansätze. Diese reichen von chemi-schen Modifikationen, Kopplung an Moleküle, die mit Rezeptoren interagieren können, Ver-kapselung in Liposomen bis zur Kondensation mit verschiedenen Polymeren. Erste klinische Versuche zeigen auch, dass siRNA-Therapien nicht frei von Nebenwirkungen sind. Diese können in drei Kategorien eingeteilt werden2: | MikroRNA-ähnliche Unterdrückung mehre-

rer mRNAs mit teilweiser Komplementarität in der nicht-exprimierten 3‘-Region,

| Immunstimulation durch Aktivierung der Toll-like Rezeptoren (TLRs) und Übersätti-gung der RNAi-Maschinerie.

| Zusätzliche Nebenwirkungen können auch durch die Komponenten der Formulierungen verursacht werden.

Eine Technologie zur Formulierung von siRNA zu wirksamenTherapeutika wird derzeit von Calando Pharmaceuticals entwickelt. Sie basiert auf linearen Polymeren, welche den zyklischen Zucker Cyclodextrin enthalten (CDP), und wurde ursprünglich am California Institute of Technology für die Formulierung von Plasmiden für die Gentherapie erfunden. Als erste Anwendung hat sich Calando auf therapetische siRNA für Krebserkrankungen fokussiert. Die Komponenten der RONDEL genannten Formulierung sind in Abbildung 1 dargestellt.

Entwicklung der RONDEL-Nanopartikel-Technologie

Nanopartikel für die Krebstherapie bedienen sich einer Vielzahl physiologischer Prozesse und Eigenschaften, um ihre Fracht in das Zielgewe-be und Tumorzellen zu schleusen (Abbildung 1). Struktur und Oberflächeneigenschaften beeinflussen dabei ihr Schicksal im Körper. Par-tikel mit einem Durchmesser zwischen 10 und 100 nm verhindern eine schnelle Auscheidung

durch die Nieren und reichern sich vorzugswei-se in Tumorgewebe an, da dieses eine anomale Vaskulatur mit undichten Blutgefässen auf-weist. Eine neutrale, geladene (< ± 10 mV) und hydrophile, mit PEG beschichtete Oberfläche minimiert die Aggregation und unspezifische Aufnahme durch Zellen des Immunsystems, während Transferrin-Liganden eine selektive Aufnahme in Krebszellen ermöglicht, die eine erhöhte Anzahl von Transferrin-Rezeptoren exprimieren. Diese Erkenntnisse sind in das Entwicklungsprogramm für RONDEL direkt eingeflossen.

Die Struktur und funktionellen Eigenschaf-ten von CDP-Polymeren sind ausgiebig in der Literatur beschrieben3–9, und nur einige herausragende Charakteristika werden hier besprochen. Cyclodextrine sind zyklische Zu-cker mit hydrophoben, zentralem Hohlraum und hydrophiler Außenfläche, welche die Fähigkeit besitzen, Einschlusskomplexe mit apolaren, organischen Verbindungen zu bilden. Die Cyclodextrine bewirken, dass die CDPs eine besonders geringe Toxizität besitzen und ermöglichen gleichzeitig die nicht-kovalente Anbindung von AD-PEG und AD-PEG-Tf über die Bildung von Einschlusskomplexen mit Adamantan. Werden Nukleinsäuren wie siRNA mit RONDEL gemischt, entstehen spontan Nanopartikel von weniger als 100 nm Durch-messer, welche auf der Oberfläche gebun-denes AD-PEG und AD-PEG-TF tragen. Diese Nanopartikel schützen die siRNA vor Abbau durch Serum-Nukleasen4. AD-PEG stabilisiert die Nanopartikel und verhindert einerseits eine Aggregation unter physiologischen Bedingun-gen10 und andererseits die unerwünschte An-reicherung der Partikel in der Lunge11. Die An-bindung von Liganden (z.B. AD-PEG-Tf) erhöht die Aufnahme durch Zellen, die entsprechende Rezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimieren5, hat aber keinen messbaren Effekt auf die Verteilung der Partikel nach intravenöser Ad-ministration12. Erste präklinische Hinweise auf einen therapeutischen Effekt von in RONDEL formulierte siRNA wurden in metastatischen Ewing-Sarkomen in Mäusen erzielt. Eine siRNA gegen das Produkt der Fusion des EWS- und FLI1-Gens, welches das treibende Onkogen für diesen Tumortyp darstellt, belegte sowohl die Unterdrückung des krebserzeugenden Genproduktes als auch einen signifikanten, krebshemmenden Effekt13.

Klinische Entwicklung

Das erste klinische siRNA-Therapeutikum auf RONDEL-Basis ist CALAA-01. Die siRNA in CALAA-01 ist gegen die Untereinheit 2 der Ribonukleotidreduktase (RRM2) gerichtet. Ribonukleotidreduktase (RR) ist ein vali-

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dertes Target in der Krebsforschung (siehe Abbildung 2), und Krebszellen, welche RRM2 überexprimieren, haben oft einen aggressi-ven und invasiven Phänotyp mit schlechter Prognose14. Oft sind diese Tumoren auch resistent gegen einige traditionelle Chemo-therapien15.

In präklinischen Versuchen zeigte CA-LAA-01 ein breites, krebshemmendes Akti-vitätsspektrum (Abbildung 2)16 und in einer Toxikologie-Studie in Affen ein vorteilhaftes Nebenwirkungs-Profil17. Eine klinische Phase I-Studie mit CALAA-01 ist derzeit im Gan-ge. Es handelt sich dabei um eine Sicher-heitsstudie mit ansteigenen Dosierungen in Patienten mit soliden, bösartigen und rezidiven Tumoren (www.ClinicalTrials.gov, Registrierungsnummer NCT00689065). Eine Zwischenanalyse von 15 Krebspatienten, welche insgesamt fünf Gruppen mit Dosen von 3, 9, 18, 24, 30 mg/m2 zugeteilt waren, zeigte, dass CALAA-01 gut toleriert wurde18. Die dem Medikament zugeschriebenen Nebenwirkungen waren hauptsächlich mild bis moderat, mit Müdigkeit, Fieber/Frösteln, allergischen Reaktionen und Störungen des Verdauungstrakts als haufigste Beobachtun-gen. Wichtig ist auch, dass keine Änderungen in Blutgerinnung, Leber-, oder Nierenfunktion festgestellt wurden.

Gewebeproben von drei Patienten mit malignem Melanom standen für pharma-kodynamische Studien zur Verfügung19. In diesen Studien wurde die Gegenwart von RONDEL-Nanopartikeln in den Tumorzellen nachgewiesen. In weiteren fanden sich in den Krebszellen nach der Behandlung tatsächlich weniger RRM2-mRNA und -protein. Außerdem konnten zum ersten Mal für eine siRNA-Thera-pie im Menschen die von der RNA-Interferenz hinterlassenen Abbauprodukte der Boten-RNA nachgewiesen werden. Zusammengenommen

zeigen diese Daten, dass eine therapeutische Anwendung systemisch verabreichter siRNAs im Menschen zumindest im Prinzip möglich ist. Weitere Studien sind jedoch nötig, um eine Aussage über die Wirksamkeit von CALAA-01 machen zu können.

Die Entwicklung von CALAA-01 läutet eine neue Ära hochspezifischer Therapien auf Basis der RNA-Interferenz ein, und weitere Medikamente auf RNA-Basis sind bereits in Entwicklung. Es wird höchst interessant sein, den Fortschritt auf diesem Gebiet mitzuver-folgen.

Literatur

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Abb. 2: : (A) Ribonukleotidreduktase (RR) ist ein essentielles Enzym, das die Herstellung von Desoxynukleinsäuren aus den entsprechenden Ribonukleinsäuren katalysiert. RR wird in allen Zellen zur DNA-Synthese und -Reparatur benötigt. (B) Wachstum von HT-144-Melanomen in Mäusen. Intravenöses CALAA-01, das an den Tagen 1, 3, 8 und 10 verabreicht wurde (D), hemmt das Tumorwachstum verglichen mit Tieren, welche eine Zuckerlösung (D5W) oder eine in RONDEL formulierte Kontroll-siRNA (siCON) erhielten.

A B

[11] Pun, S. H. et al. Targeted Delivery of RNA-Cleaving DNA Enzyme (DNAzyme) to Tumor Tissue by Transferrin-Modified, Cyclodextrin-Based Particles. Cancer Biol Ther 3, 641-650. Epub 2004 Jul 2009. (2004).

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[19] Davis, M. E. et al. Evidence of RNAi in humans from sy-stemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature 464, 1067-1070 (2010)


Thomas Schluep, Sc.D. Chief Scientific OfficerCalando Pharmaceuticals, Inc. 201 S. Lake Ave., Suite 703 Pasadena, CA 91101Tel.: +1-(0)626-304-3400 Fax: +1-(0)[email protected]


LABORWELT

Zellbasierte Assays im NanoformatAlmut Gebhard, Katrin Welzel, Dr. Wilfrid Weigel, Scienion AG, Dortmund/Berlin Dr. Béatrice Schaack, Institut de Biologie Structurale, Grenoble

Durch miniaturisierte Testverfahren lassen sich wertvolle Substanzen einsparen und Multiplex-Analyseverfahren effizient durchführen. In der pharmazeutischen Wirkstofffor-schung spielen zellbasierte Assays eine wichtige Rolle, insbesondere wenn mit humanen Zellen als Modellsystem durchgeführt. Miniaturisierte Testverfahren ermöglichen das High Throughput- sowie High Content-Screening. Allerdings erfordert die Assayentwicklung besondere Sorgfalt, da lebende Zellen im Unterschied zu chemischen oder biologischen Substanzen sehr empfindlich sein können, die Funktionalität der Zellen aber eine Voraus-setzung dafür ist, reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Dafür wichtige Parameter sind die Art der Kultivierung, Belüftung und das Vermeiden von Kontaminationen sowie der Umgang mit den Zellen. Intelligente Laborautomation ist ein wesentlicher Bestandteil, um konstante Bedingungen für erfolgreiche Experimente zu gewährleisten. Heutzutage sind Entwicklung und Durchführung von Multiplex-Assays ohne moderne Laborautomatisierung nicht denkbar.

Hier stellen wir einen zellbasierten Assay vor, mit dem sich gleichzeitig die Wirkung des Platin-basierten, DNA-vernetzenden Che-motherapeutikums Cisplatin (CDDP) und die Konsequenzen einer gegen das ERCC1-Gen gerichteten siRNA-Transfektion analysieren lassen. Das miniaturisierte Testverfahren na-mens „DropChip-Test“, wurde im Laboratoire Biopuces, CEA, in Grenoble entwickelt.

Cisplatin ist ein Apoptose-induzierendes Zytostatikum, das zur Behandlung zahlreicher Tumore eingesetzt wird. Wie bei vielen Wirk-stoffen sind auch gegen Cisplatin Resistenz-bildungen beobachtet worden. Resistenzen gegen Cisplatin korrelieren u.a. mit einer verstärkten Aktivität des ERCC1-Gens, das ein Schlüssel-Enzym des dimeren Nukleotid-

Zell-Microarrays haben sich als Technologie zur phänotypischen Untersuchung von Genotypen etabliert. Sie stellen sowohl ein wertvolles Werkzeug zur Überexpression von Proteinen als auch eine direkte Methode für funktionelle Studien mittels knock-out-Experimenten dar. RNAi, das Stummschalten von Genen auf post-transkriptioneller Ebene durch sequenzkomplenentäre dsRNA und small interfering RNAs (siRNAs) in Organis-men von Fadenwürmern bis zum Menschen ist ein Standardinstrument im Arsenal des Zellbiologen. Der gezielte ‚knock-down‘ von Genen ist von besonderem Nutzen bei der Analyse von molekularen Mechanismen und der Bestimmung epistatischer Bezie-hungen.

Für Transfektionsexperimente gibt es zwei Wege: Bei der direkten Transfektion werden erst Zellen auf den Träger gespottet und dann die Transfektionsreagenzien zugeführt. Bei der reversen Transfektion werden DNA und Transfektionsreagenzien vorgespottet und anschließend die Zellen zugegeben. Die Transfektionseffizienz wird durch fluoreszie-rende Proteine nach 48 Stunden Inkubation gemessen. Während die direkte Transfektion effizienter und einfach durchzuführen ist, eig-net sich die indirekte Transfektion besser für die Massenproduktion: die mit Nukleinsäuren vorgespotteten Träger können vor ihrem Einsatz für RNAi- oder Expressionsanalysen monatelang gelagert werden.

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Direkte oder reverse Transfektion zwecks Gene Silencing

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Blitzlicht Automation

Abb. 1: Mit dem sciFLEXARRAYER wurden 100 nl-Tröpfchen U373-Zellen auf den DropChip-Träger gespottet.

Abb. 2: Assayauswertung: Rotfärbung der mit unterschiedlichen Konzentrationen an anti-ERCC1-siRNA transfizierten U373-Zellen durch das Ethidium-Homodimer 2 – mit oder ohne Cisplatinbehandlung

Exzisions-Reparatur (NER)-Komplexes kodiert. Die normalerweise sinnvolle Schutzfunktion des ERCC1 (Excision Repair Cross Complement Group 1) wirkt sich bei einer Krebstherapie offensichtlich kontraproduktiv aus.

Der Assay sollte dazu dienen, einen potenziel-len Kausalzusammenhang dieser Korrelation zu überprüfen, also zu evaluieren, ob sich durch den siRNA-induzierten posttranslationalen Abbau der ERCC1-mRNA (Gene Silencing) die zytotoxische Wirksamkeit von Cisplatin wie-derherstellen lässt. Dazu stellte das Labor zu-nächst eine siRNA gegen einen DNA-Abschnitt innerhalb der kodierenden Region des ERCC1-Gens her.

DropChip-Format – Alternative zu Assays in Mikrotiterplatten

Für gewöhnlich werden zellbasierte Assays in Mikrotiterplatten mit mehr als 10.000 Zellen pro Well durchgeführt. In dem neuartigen DropChip werden nur rund 100 Zellen in Nano-litertröpfchen auf einem Glasträger kultiviert, und der Phänotyp einzelner Zellen kann nach dem Kontakt mit Nukleinsäuren oder Wirkstof-fen analysiert werden. Bei der Etablierung des Testaufbaus hat sich gezeigt, dass die DropChip-Methode wesentliche Vorteile gegenüber dem geläufigen Verfahren bietet: Die Tröpfchen verhalten sich wie unabhängige Zellkulturen und stellen einen eigenen Reaktionsraum dar, der durch einen hocheffizienten Gasaustausch und eine kontinuierliche Flüssigkeitsbewegung gekennzeichnet ist. Bei Tröpfchen mit Volumina von weniger als 1 µl sind Gestalt und Lokali-sierung der Tröpfchen vorwiegend durch die

Eigenschaften der Glasoberfläche bestimmt. Die Flüssigkeitskonvektion innerhalb der Trop-fen ermöglicht sehr gute Bedingungen für das Screening, und die Anzahl von Zellen kann für jedes Experiment individuell angepasst werden. In Vorversuchen, die zugleich das Potential der DropChip-Technologie für vielfältige Anwen-dungen aufzeigten, wurden DropChip-Assays sowohl zur reversen als auch direkten Transfek-tion verwendet (siehe Kasten). Außerdem wurde die Effizienz der Transfektion bei Verwendung unterschiedlicher DNA-Typen (Oligonukleotide, PCR-Fragmente und Plasmide) in zwei Zelllinien untersucht und die Expression verschiedener fluoreszierender Proteine getestet.

Untersuchung der Toxizität und Dosis-Wirkungsbeziehung

In den anschließend durchgeführten Experi-menten wurde sowohl die Dosisabhängigkeit der siRNA-Wirkung bei gleichzeitiger Cispla-tingabe getestet als auch potentielle toxische Effekte der siRNA in Abwesenheit von Cisplatin. Dazu wurden Humanzellen eines bösartigen Hirntumors (Glioblastom) verwendet, der re-sistent gegen Cisplatin ist (U373-Zellen). Für die direkte Transfektion wurden 100 nl U373-Zellen mit dem sciFLEXARRAYER (Scienion AG) auf einen speziell angefertigten DropChip-Träger mit 400 Positionen (Memscap SA) gespottet (siehe Abb. 1), mit 5µM Cisplatin behandelt und danach mit siRNA gegen das ERCC1-Gen transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion und Inkubation in einer feuchten Kammer wurden die Chips mit Ethidium-Homodimer-2 gefärbt (Lebend-Tot-Test), fixiert und mikros-

kopisch ausgewertet. Beim Spotten von Zel-len besteht das Risiko ihrer Schädigung durch mechanischen Stress sowohl beim Erzeugen als auch beim Absetzen der Tropfen auf der Chipoberfläche. Dieses Problem wurde durch die Anpassung des Designs der Printdüsen und der Einstellungen für die Pulsparameter bei der piezo-elektrischen Tropfenerzeugung minimiert.

Mit Cisplatin behandelte und mit anti-ERCC1-siRNA transfizierte U373-Zellen zeigten eine Rotfärbung, deren Intensität mit der Konzent-ration der siRNA korreliert. In Abwesenheit von Cisplatin zeigte sich in einem Konzentrations-bereich von 5-100 nM keine Färbung der U373-Zellen, also keine toxische Wirkung der siRNA (siehe Abb. 2). Mit dem Testverfahren konnten Gene Silencing und Medikamentenscreening kombiniert werden, um die Hypothese der Im-plikation des ERCC1-Gens auf die Wirksamkeit von Cisplatin zu bewerten.

Das Anwendungspotential für das neuartige reagenzien- und zellsparende Testformat ist groß. Sinnvoll erscheinen insbesondere funktio-nelle Genomstudien und in vitro-Toxizitätstests. So könnten zellbasierte Assays wie DropChip für die Bewertung der Toxizität von Wirkstoffen in einem frühen Entwicklungsstadium eingesetzt werden. Durch die Miniaturisierung lassen sich erhebliche Einsparpotenziale realisieren – dies betrifft teure Wirkstoffkandidaten und Zelllinien ebenso wie sämtliche Verbrauchsmaterialien. Anders als bei traditionellen biochemischen Tests lassen sich zudem zusätzlich Informatio-nen wie etwa Absorption, Permeabilität, Selek-tivität, Spezifität, Metabolismus und Toxizität erhalten.


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Report Einzelzellanalytik

Zellkommunikation als Bestandteil der mukosalen ImmunabwehrTamas Dolowschiak, und Mathias Hornef; Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene, Medizinische Hochschule, Hannover

Kommunikation zwischen individuellen Zellen ist ein Kennzeichen aller multizellulären Or-ganismen. Die Interaktion zwischen benachbarten Zellen trägt zur koordinierten Funktion in vielen Organsystemen bei. Wir haben untersucht, ob nach Infektion einzelner Zellen mit Listeria monocytogenes die Kommunikation zwischen Epithelzellen zu einer effektiven Im-munabwehr benachbarter Epithelzellen beiträgt. Mit Hilfe des Listeria-Infektionsmodells und durch experimentelle Untersuchung der bakteriellen Infektion und Zellstimulation auf Einzelzellebene konnten wir zeigen, dass die epitheliale proinflammatorische Zellantwort vor allem durch nicht-infizierte Zellen vermittelt wird – und das, obgleich Listeria erst nach Eindringen in die Zelle durch deren Rezeptoren des angeborenen Immunsystems erkannt wird. Grundlage für die epitheliale Kommunikation – also das Weitergeben der Information, dass eine bakterielle Invasion aufgetreten ist, zwischen den einzelnen Epithelzellen – ist die Synthese von Sauerstoffradikalen in den infizierten Zellen. Damit ergibt sich ein neues Konzept der ko-ordinierten epithelialen antimikrobiellen Wirtsantwort nach Stimulation einzelner Mitglieder eines Zellverbundes. Diese könnte wesentlich zu einer effektiven Bekämpfung pathogener Infektionserreger beitragen.

lerdings noch nicht analysiert. Daher war es unser Ziel, ein Modell zu etablieren, das eine Analyse sowohl der mikrobiellen Infektion und Zellaktivierung als auch der Zellstimu-lation auf Einzelzellebene erlaubt3.

Indirekte Zellaktivierung als Folge einer Zell-Zell-Kommunikation

Listeria monocytogenes ist ein humanpathoge-ner Erreger und verursacht beim empfindlichen Wirt Meningitis, Sepsis und Abort. Listerien werden über die Nahrung, vor allem durch die Aufnahme von Rohmilch oder mit Rohmilch hergestelltem Weichkäse aufgenommen. Das fakultativ anaerobe, Gram-positive Bakterium ist nach oraler Aufnahme in der Lage, die Epi-thelzellschicht im Darm zu durchdringen und eine systemische Infektion zu verursachen. Die Bakterien adhärieren an die apikale Epithelzell-membran und induzieren ihre Aufnahme durch Stimulation der Endozytose. Anschließend be-freien sie sich durch Sekretion des membranzer-störenden Toxins Listeriolysin O (LLO) aus dem Endosom und entgehen so der Endosom-Lysoso-men-Fusion und damit der Abtötung durch die Zelle. Einmal in die Zelle freigesetzt, sind sie in der Lage, sich frei im Zytosol zu bewegen. Durch polare Expression des Aktin-bindenden Proteins ActA bilden sie dynamische Aktinpolymere, die einen schnellen Antrieb der Bakterien im Zytosol vermitteln und sogar die Invasion benachbarter Zellen ermöglichen4.

Wichtige Kriterien für die Auswahl dieses Bakteriums für unser Modell waren zwei cha-rakteristische Eigenschaften:I Listerien werden von Epithelzellen erst nach

Lyse der Endosomenmembran im Zytosol durch Rezeptoren des angeborenen Immun-systems erkannt. Extrazelluläre Bakterien führen hingegen nicht zu einer Epithelzell-stimulation.

I Nach Lyse des Endosoms findet sich eine deutlich verstärkte Expression des ActA-Proteins. Durch Expression eines leicht detektierbaren Markerproteins wie des Grün fluoreszierenden Proteins (GFP) unter der Kontrolle des ActA-Promoters konnten wir spezifisch Bakterien anfärben, die das

Abb 1: Analysemodelle auf Einzelzellebene

Epithelzellen bedecken alle mukosalen Körperoberflächen. Im Darmtrakt bildet eine einzelne Zellschicht die Grenzfläche zwischen dem durch eine Vielzahl an Bak-terien besiedelten Darmlumen und dem weitgehend sterilen subepithelialen Ge-webe. Epithelzellen im Darm ermöglichen die Resorption von Nahrungsbestandteilen und Flüssigkeit, tragen aber durch das Erken-nen pathogener Mikroorganismen und die Bildung antimikrobieller Substanzen auch aktiv zur Aufrechterhaltung der mukosalen Barriere bei1-2. Die Erkennung pathogener Mikroorganismen geschieht durch die Ex-pression einer Vielzahl von Rezeptoren des angeborenen Immunsystems bzw. bestimm-ter konservierter mikrobieller Strukturen, sogenannter Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Die Stimulation dieser Re-

zeptoren löst die Produktion antimikrobieller Substanzen und die Sekretion löslicher Me-diatoren aus, die professionelle Immunzellen an den Ort der Infektion rekrutieren.

Nur Analysen auf Einzelzellebene gestat-ten ein Verständnis der Interaktion zwischen Zellen eines Zellverbundes oder innerhalb eines Organs und damit der Komplexität stimulatorischer und regulatorischer Pro-zesse innerhalb heterogener Gewebe. In verschiedenen zellulären Systemen wurden solche Analysen durchgeführt; sie belegten die Bedeutung der Kommunikation zwischen Zellen für die Gesamtantwort eines Zellver-bundes. Das Bestehen einer horizontalen epithelialen Kommunikation und die Be-deutung für die Induktion einer effizienten Immunreaktion und antimikrobiellen Wirts-abwehr an mukosalen Oberflächen wurde al-

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Report Einzelzellanalyse

Zytosol erreicht hatten und damit in der Lage waren, die Epithelzelle zu stimulieren.

Durch Infektion eines konfluenten Epithelzell-rasens mit einer nur relativ geringen Anzahl Bakterien war es in diesem Modell möglich, nur eine kleine Fraktion von Zellen zu stimu-lieren und gleichzeitig die stimulierten Zellen mit fluoreszierenden Bakterien zu markieren. Als Wirtszelle wählten wir die murine Dünn-darmepithellzelllinie m-ICcl2

5. Diese Zellen bilden in Kultur einen konfluenten Rasen polarisierter Zellen mit Ausbildung typischer Zell-Zellkontakte und apikaler Mikrovilli und zeigen nach Infektion mit L. monozytogenes eine Invasions-abhängige Sekretion des pro-inflammatorischen Chemokins Macrophage inflammatory protein 2 (Mip-2, Cxcl-2). Mip-2 läßt sich sowohl im Zellkultur-Überstand als auch nach Hemmung der Sekretion durch Brefeldin A immunhistologisch und durchfluss-zytometrisch nachweisen. Beide zuletzt ge-nannten Verfahren erlauben eine Auswertung der zellulären Stimulation auf Einzelzellebene, was ein notwendiges Kriterium für unsere Analysen darstellt (Abb. 1).

Die immunhistologische Untersuchung nach Infektion mit reportergentragenden L. monozytogenes ergab eine Mip-2-Synthese überwiegend in nicht-infizierten (d.h. auch nicht-stimulierten) Epithelzellen (Abb. 1a). In-

teressanterweise fanden sich die stimulierten Epithelzellen jedoch meist in unmittelbarer Nachbarschaft Listeria-positiver Zellen. Ähn-liche Befunde ergab auch die durchfluss-zytometrische Analyse: Die Mehrzahl der Mip-2-positiven Zellen lag nicht innerhalb der Population Listeria-positiver Zellen. Durch Sortierung Listeria-infizierter und Listeria-negativer Zellen und anschließende quan-titative RT-PCR auf Mip2-mRNA konnte die Aktivierung nicht-infizierter Zellen bestätigt werden. Nach Ausschluss indirekter Listeria-induzierter Wege der Zellstimulation – etwa durch die Sekretion des Listeriolysins selbst–, war damit klar, dass eine Kommunikation zwi-schen Listeria-infizierten und nicht-infizierten Zellen bestehen muss, die zu einer indirekten Aktivierung sowie zur Synthese und Sekretion des proinflammatorischen Chemokins Mip-2 in benachbarten Zellen führt.

Reaktive Sauerstoffradikale – Signale der indirekten Epithelzellaktivierung

Verschiedene Mechanismen der indirekten Zellaktivierung erschienen denkbar. Sekre-tierte und durch Oberflächenrezeptoren er-kannte Mediatoren wie Proteine oder Prosta-glandine, Ionenströme entlang benachbarter

Zellmembranen oder der Transport von kleinen Signalmolekülen durch kleine Kanäle, die die Epithelzellen verbindende (sog. Gap junctions) könnten die indirekte Aktivierung vermitteln. Allerdings fand sich im Über-stand infizierter Zellen durch Transfer kon-ditionierten Zellkulturüberstandes zu naiven Epithelzellen keine stimulatorische Aktivität. Auch war die indirekte Zellaktivierung nicht von der epithelialen Proteinsekretion oder Prostaglandinsynthese abhängig. Weiter-hin war eine pharmakologische Hemmung verschiedener bekannter Ionenkanäle nicht in der Lage, die Stimulation nicht-infizierter Zellen zu vermindern. Obwohl der Transport zwischen benachbarten Epithelzellen nach Mikroinjektion des niedermolekularen fluo-reszenten Farbstoffes Lucifer Yellow (LY) und damit die Anwesenheit funktioneller Gap junctions in unserem Modell nachweisbar war (Abb. 1b), ergab die pharmakologische Hemmung der Kanäle keine Reduktion der epithelialen Kommunikation.

Eine Bedeutung unstabiler Signalmoleküle bei der indirekten Zellaktivierung konnte durch die oben beschriebenen Experimente jedoch nicht ausgeschlossen werden. So wurde etwa die Expression verschiedener Isoenz yme der NADPH- Oxidase durch Epithelzellen beschrieben, die die Synthe-se reaktiver Sauerstoffradikale (reactive oxygen intermediates, ROI) ermöglichen6-7. Tatsächlich führte die pharmakologische Inhibition reaktiver Sauerstoffradikale zu einer signifkanten Reduktion der indirek-ten Zellaktivierung. Auch konnten reaktive Sauerstoffradikale nach Infektion in fo-kalen Zellverbünden um Listerien-positive Epithelzellen nachgewiesen werden (Abb. 1c). Dies könnte für eine Listerien-induzierte Synthese von Sauerstoffradikalen in infi-zierten Zellen und die laterale Verbreitung dieser hochreaktiven Moleküle zu benach-barten Epithelzellen sprechen. Tatsächlich war die Listerien-induzierte Stimulation der mitogenaktivierten Protein (MAP)-Kinase Erk, die zusammen mit den MAP-Kinasen p38 und JNK für die Mip-2-Synthese ver-antwortlich ist, abhängig von der Synthese reaktiver Sauerstoffradikale. Schließlich ließ sich durch Zugabe eines Sauerstoffradikale-freisetzenden Substrates in das Zellkultur-medium oder Injektion dieses Stoffes direkt in einzelne Zellen durch Mikroinjektion die Synthese von Mip-2 induzieren. Dabei fand sich ähnlich wie nach Listerien-Infektion die Produktion von Mip-2 auch in benachbarten Zellen. Damit konnte die epitheliale Synthese von Sauerstoffradikalen nach Listerien-Infektion und die dadurch vermittelte MAP Kinase-abhängige Synthese des Chemokins Mip-2 in nicht-infizierten Zellen gezeigt

Abb 2. Horizontale Zell-Zell-Kommunikation nach Stimulation von Rezeptoren des angeborenen Immunsystems

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und Sauerstoffradikale als bei der indirekten Epithelzellaktivierung nach Listerien-Infektion beteiligter Faktor identifiziert werden (Ab-bildung 2).

Hinweise auf Zell/Zell-Kommunikation

In den letzten Jahren wurde vor allem durch die Arbeitsgruppe um David Hackam intensiv an der Bedeutung der Enterozytenfunktion in der Pa-thogenese der Nekrotisierenden Enterokolitis des Neugeborenen (NEC) gearbeitet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die über Gap junctions stimulierte, koordinierte Wundheilung des Darmepithels durch Zytokine wie Interferon (IFN)-g gehemmt wird8. Auch konnte nach Stimulation durch doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure (dsDNS) ein Gap junction-vermittelter Informationsaustausch zwischen den Zellen und eine dadurch verstärkte Sekretion von Zytokinen wie IFN-g und TNFa nachgewiesen werden9. Parallel zu unseren Untersuchungen wurde durch eine Arbeitsgruppe in Basel in einem anderen Modell eine Be-deutung der horizontalen Kommunikation zwischen Epithelzellen nach bakterieller Infektion nachgewiesen. Dabei wurde das enteropathogene, Gram-negative Bakterium Shigella flexneri eingesetzt. Ähnlich wie Liste-ria induziert Shigella seine Aufnahme in Epithelzellen und erreicht das Zytosol nach Lyse der endosomalen Membran10. In den in dieser Arbeit verwendeten Zellen wurde auch mit Shigella eine Zellaktivierung nur nach Invasion, also durch das Erkennen zytosolischer Bakterien durch dort lokalisierte Rezeptoren des angeborenen Immunsystems hervorge-rufen. Dabei wurde eine Bedeutung des Gap junction-Transportes für die Kommunikation zwischen Epithelzellen und die durch nicht-infizierte, benachbarte Epithelzellen verstärkte Wirtsabwehreaktion identifiziert 11. Das durch die Gap junctions transportierte Signalmolekül ist allerdings noch nicht bekannt.

Damit konnten unsere Arbeiten einen neuen und überraschenden Aspekt der Wirtsabwehr nach Stimulation des angeborenen Immun-systems beschreiben. Die Kommunikation zwischen Epithelzellen des Darmes durch Bildung reaktiver Sauerstoffradikale ermöglicht eine koordinierte und potenzierte antimikrobielle Reaktion des Epithels und vermindert die Effektivität mikrobieller Strategien der zellulären Immunevasion.

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33(5):804-16.


Prof. Dr. med. Mathias HornefInstitut für Medizinsche Mikrobiologie und KrankenhaushygieneMedizinische Hochschule HannoverCarl-Neuberg Str. 130625 HannoverTel.: +49-(0)511-532 4540Fax.: +49-(0)511-532 [email protected]/7730.html

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Blitzlicht Zytotoxizitätstestung

Ein Echtzeitsystem zur präklinischen Testung der Kardiotoxizität Dr. Markus Scheuermann, Roche Applied Science, Penzberg

Kardiotoxische Nebenwirkungen von Arzneimittelkandidaten sind einer der häufigsten Gründe für den vorzeitigen Abbruch kostspieliger klinischer Studien. Bisherige in vitro-Screeningtests, die die Vorhersage kardiotoxischer Effekte zum Ziel haben, weisen meist Surrogatmarker anstelle wichtiger Endpunkte wie der kardialen Arrhythmie oder der Q/T-Prolongation selbst nach. Das hier vorgestellte RTCA Cardio Instrument (Roche Applied Sci-ence, Penzberg) ermöglicht durch Echtzeit-Impendanzmessung die Überwachung kurz- und langfristiger Substanzwirkungen auf schlagende Kardiomyozyten. Das Instrument integriert damit Informationen über die Antwort aller Ionenkanäle und anderen an der Reizweiterleitung im Herzen beteiligten Komponenten auf extern zugeführte Substanzen. Durch Kombination eines physiologisch relevanten Kardiomyozytenmodells mit dem RTCA Cardio Instrument können, wie im folgenden gezeigt, frühe Voraussagen sowie mechanistische Informationen zur Kardiotoxizität erhalten werden.

hERG-Assays sind derzeit ein zentraler Bestandteil regulatorischer Richtlinien zur Risikoabschätzung kardialer Nebenwirkun-gen.Da sich mit hERG-Assays ventrikuläre Arrhythmien aber nicht vollständig vorher-sagen und kompensatorische Effekte, die durch Modulation anderer Kanäle2 auftreten, gar nicht erfassen lassen, besteht Bedarf an in vitro-Modellen, mit denen sich der Effekt von Wirkstoffen auf den Gesamtprozess der Reizweiterleitung und Kontraktion im Herzen erfassen lässt.

Einen solchen integrierten Ansatz zur in vitro-Kardiotoxizitätstestung präklinischer Arzneimittelkandidaten bietet die Unter-suchung funktionaler Kardiomyozyten mit Hilfe des RCTA Cardio Instrumentes. Das

Unerwünschte kardiale Nebenwirkung waren in den beiden letzten Jahrzehnten ein Haupt-grund für den Abbruch klinischer Studien, für Sicherheitswarnungen bereits zugelassener Arzneien sowie den Entzug ihrer Marktzulas-sung. Die meisten der wegen kardiotoxischer Nebenwirkungen vom Markt genommenen Wirkstoffe stören die Herzfunktion, indem sie die ausbalancierte elektrische Aktivität des Herzens beeinträchtigen. Störungen des fein-orchestrierten kanalvermittelten Transportes von Kalzium-, Natrium- und Kalium-Ionen über die Kardiomyozytenmembran wirken sich auf die Kopplung von Erregung und Kontraktion im Herzen aus. Sie können zu lebensbedroh-lichen ventrikularen Arrhythmien führen, den Torsade-de-Pointes-Tachykardien.

nicht-invasive, labelfreie Messverfahren auf Basis von Impedanzmessungen (siehe Kasten) ermöglicht die Vorhersage der Kardiotoxizität sowie Einblicke in den Toxizitätsmechanismus präklinischer Arzneimittelkandidaten. Grund-lage ist das Echtzeitmonitoring des Schlag-verhaltens kultivierter Kardiomyozyten über Tage bis Wochen.

Integrierter Ansatz zur Untersuchung der Kardiotoxizität

Die Kardiomyozyten entwickeln bei Auf-nahme von interzellulären Kontakten in der Zellkultur synchrone Aktivitäten. Ar-rhythmisch und antiarrhythmische Effekte können mit dem RTCA Cardio gescreent, analysiert und quantif iziert werden. Im Gegensatz zur Patch-Clamp-Technik erfolgt die Analyse nicht an Einzelzellen, sondern im Zellverbund und statt auf der „Entstehungs-seite“ (Depolarisation) auf der Reaktionsseite (Kontraktion).

Herzstück des Systems ist ein mikroelek-tronischer Cell Sensor Array am Boden einer 96-well-Mikroplatte (E-plate Cardio 96), mit dem via Messung der Impedanz der Kontraktions/Relaxationszyklus schlagender Kardiomyozyten quantiativ erfasst werden kann. Hier wird gezeigt, wie sich das System zur Kardiotoxizitätstestung an funktionalen Mauskardiomyozyten einsetzen lässt.

Um die Schlagaktivität zu charakterisieren, wurden in jedes Well der E-Plate 60.000 lebende, aus embryonalen Stammzellen der Maus gewonnene CorAt®-Zellen (Axiogenesis AG, Lonza, Köln) gegeben und die Zellen bis zu 96 Stunden in Kultur beobachtet. Dabei wurde die Schlagaktivität einmal pro Stunde für 20s erfasst. 48 Stunden nach Aussaat der Zellen hatte sich ein reproduzierbar synchron schlagender Kardiomyozyten-Monolayer am Boden jedes Wells gebildet (vgl. Abb. 1, links oben). Die Schlagfrequenz lag initial bei 80 Schlägen pro Minute, stieg aber nach einem Monat in Kultur progressiv auf 250 Schläge pro Minute an.

Pharmakologische Untersuchung schlagender Herzzellen

In den zellbasierten Assays wurde zunächst die Wirkung ansteigender Konzentratio-nen fünf verschiedener Pharmaka auf die Schlagcharakteristika von Cor.At®-Zellen mit dem RTCA Cardio Instrument über drei Tage verfolgt. Dabei zeigte sich, dass sich mit der vorgestellten Strategie sowohl kurzfristige als auch verzögert auftretende Effekte auf die Ionenkanalaktivität und andere für die Herzzellfunktion wichtige Targets untersu-chen lassen. Abbildung 1 zeigt die mit dem hier vorgestellten Ansatz gemessenen Effekte ionotroper und anderer Schlagfrequenz- mo-

Das seit Herbst 2010 verfügbare RTCA Cardio Instrument ermöglicht das nicht-invasive in vitro-Monitoring schlagender Kardiomyozy-ten in Echtzeit in mittlerem Durchsatz. Zur Messung wichtiger Kardiomyozytenfunk-tionen wie der Schlagfrequenz, Amplitude, Schlagdauer etc. dient die „E-Plate Cardio 96“, die mittels Goldelektroden am Boden der 96-well-Mikro titerplatte Messungen der Impedanz mit einer Datenaquisitionsrate von 12,9 ms/Platte ermöglicht. Die Messsignale werden von der RTCA Cardio Station (rechts) an den RTCA Cardio Analyzer (links) weiterge-leitet, in dem die Datenverarbeitung mithilfe der RTCA Software stattfindet.


In vitro-Kardiotoxizitätstest mit dem RTCA Cardio Instrument

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dulierender Pharmaka, die sich als konsistent mit tierexperimentellen bzw. publizierten Daten erwiesen.

So wurde für den spannungsaktivierten L-Typ Calcium-Kanal-Blocker Isradipine (Abb. 1A) ein IC50-Wert von 19,7 nM bezogen auf die normalisierte Schlagaktivität und von 42,3 nM bezogen auf die Amplitude ermittelt. Diese Werte sind konsistent zu entsprechenden halbmaximalen Inhibitorkonzentrationen, die an isoliertem Kaninchenherz bestimmt wurden.

Auch für Herzfrequenz-steigernde Calcium-Kanal-Agonisten wie S-(–) BayK 8644 lieferte die Messung mit dem RCTA Cardio Instrument eine Dosis-Wirkungsbeziehung (Abb. 1B), die konsistent mit den in der Literatur beschrie-benen Daten ist.

Abb. 1: Mit dem RTCA Cardio Instrument erfasste Schlagaktivität und „Cell index“ (CI) von Cor.At-Zellen zu verschiedenen Zeiten nach Aussaat der Zellen (0ben links). Die Schlagrate ist in 1/min, die Amplitude in DCI angegeben. Daten aus dem Durchschnittswert von je acht Wells ± Stan-dardabweichung wurden zugrundegelegt. (A-E) Pharmakologische Untersuchung von Ionenkanal- und Nicht-Ionenkanal-Targets. Nach Aussaat in die E-Plate Cardio 96 wurden die Schlagcharakteristika von Cor.At®-Zellen über drei Tage bei ansteigendenden Substanzkon-zentrationen beobachtet. (A) Isradipin, ein L-Typ spannungsabhängiger Calciumkanal-Inhibitor, (B) (S)-(-)Bay K 8644, ein L-Typ spannungs-abhängiger Calciumkanal-Agonist, (C) Tetrodotoxin (TTX), ein Inhibitor spannungsabhängiger Na+-Kanal-Blocker, (D) E4031, ein ERG-Typ Kalium-Kanal-Hemmstoff, (E) Isoproterenol, ein Agonist des beta-adrenergen Rezeptors.

Für den Hemmstoff spannungsabhängiger Na-triumkanäle Tetrodotoxin konnte die erwartete dosisabhängige Abnahme der Herzschlagfre-quenz gemessen werden (Abb. 1C).

Behandlung der Cor.At-Zellen mit dem ERG-Kanal-Blocker E4031 führte in einem Konzent-rationsbereich von 200 nM bis 800 nM zu den charakteristischen Arrhythmien mit verlänger-ter Schlagdauer und Plateau-Oszillationen, die auch von hERG-Inhibitoren induziert werden (Abb. 1D). Die mit dem RCTA Cardio Instrument ermittelten Parameter erwiesen sich auch hier konsistent zu Daten, die mithilfe von Patch Clamp-Ableitungen, dem derzeitigen experi-mentellen Standard, ermittelt worden waren.

Daneben wurde auch geprüft, ob sich die Wirkung von Agonisten des b-adrenergen Re-zeptors mit dem RTCA Cardio Instrument mes-

sen lässt. Über die Rezeptor-Aktivierung wird die neurohormonale Regulation der Kontrak-tilität und der Schlagrate des Herzens vermit-telt. Behandlung mit dem Rezeptor-Agonisten Isoproterenol erhöhte dosisabhängig die Schlagfrequenz in Cor.At®-Kardiomyozyten und verlängerte die Schlagdauer (Abb. 1E). Der zur Charakteristik von S-(–) BayK 8644 ähnliche Effekt ist konsistent mit der Beob-achtung, das der b-adrenergen Rezeptor L-Typ Calciumkanäle aktiviert.

Einsatz des RTCA Cardio Instrumentes in präklinischen Sicherheitsstudien

Um den Nutzen des RTCA Cardio Instrumen-tes im präklinischen Toxizitätsscreening zu

Schlagcharakteristika ohne Substanzeinwirkung

Schlagcharakteristika nach Substanzeinwirkung




Abb. 2: Kardiotoxizitäts-Profiling mit dem RTCA Cardio Instrument. (A) Die wegen der Induktion von Torsade-de-Pointes-Tachykardien vom Markt genommenen Wirk-stoffe Astemizol, Cisaprid, Droperid und Sertindol wurden in Cor.At-Zellen unter-sucht. Gezeigt sind die Dosis-abhängigen Effekte. Außer für Cisprid (Startkonzen-tration 10 µM) wurden Zweifachverdünnungen ausgehend von einer Anfangskon-zentration von 20µM getestet. (B) Messung der Auswirkungen einer 20 µM-Dosis des indirekten hERG-Kanal-Modulators Pentamidin auf Cor.At®-Zellen über drei Tage.

prüfen, wurde eine duale Strategie verfolgt: Vier vom Markt genommene direkte hERG-Kanal-Inhibitoren wurden in verschiedenen Konzentrationen an Cor.At-Kardiomyozyten getestet. Jeder der getesteten Substanz zeigte bei Screening mit dem RCTA-Cardio Instrument das bereits für ERG-Blocker (vgl. Abb. 1D) gezeigte charakteristische Aktivitäts-muster (Abb. 2A). Dies legt einen ähnlichen Toxizitätsmechanismus nahe. Desweiteren wurde ein indirekter Modulator des hERG-Kanals (Pentamidin) untersucht, der über eine Verzögerung der Repolarisation wirkt. Verabreichung von Pentamidin in einer Kon-zentration von 20µM zeigte erst 900min nach Administration einen messbaren Effekt auf die Kardiomyozyten-Aktivität. Dies zeigt, dass die vorgestellte Methode – im Gegensatz zu Patch Clamp-Ableitungen, die nur für wenige Minuten möglich sind– , für die Messung ver-zögerter Toxizitätseffekte geeignet ist.


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Blitzlicht Probenvorbereitung

Einfluss der Proben qualität auf die Ergebnisse zellbasierter Assays Camilla Piper, Indivumed GmbH, Hamburg

Dass die Aussagekraft wissenschaftlicher Arbeit von der Qualität der eingesetzten Materi-alien abhängt, ist eine triviale Erkenntnis. Weit komplexer ist aber oft die Abwägung, was ein guter Kompromiss zwischen Wirtschaftlichkeit und hohem Qualitätsniveau ist. Denn gute Qualität bedeutet meist auch einen hohen Preis. Dabei ist nicht nur die Kosten-Nutzen-Betrachtung einzelner Komponenten wichtig, sondern ganz besonders das Identifizieren der für die Ergebnisqualität maßgeblichen Parameter. Nicht selten verlangt dies sehr spezielles Fachwissen, das zudem ständigem wissenschaftlichen Wandel unterliegt. Nationale und internationale Institutionen wie die National Cancer Institutes (NCI) und die EORTC (Euro-pean Organisation for Research and Treatment of Cancer) haben in den letzten Jahren große Geldsummen und viel Anstrengung investiert, um das Bewusstsein für Probenqualität bei Wissenschaftlern und Entscheidungsträgern in Wirtschaft und Politk zu wecken und um „best practices“ zu finden und nationale und internationale Standards festzulegen, die die klinische Testung erleichtern.

nämlich auch die Bedeutung von Therapien klar, die der Spender kurz vor der Probenent-nahme erhalten hatte. Dazu kamen Fragen zum allgemeinen Lebensstil.

Die nächste Qualitätsdimension einer Probe wird derzeit in die allgemeine Praxis eingeführt – genetische Veränderungen in Tumorzellen wie etwa der Mutationsstatus. Treiber dieses Qualitätsmerkmals ist die auf den einzelnen Pa-tienten zugeschnittene Therapie und Diagnose. Die frühere Vorstellung, ein Krebsleiden sei or-

ganspezifisch zu untersuchen und weitgehend einheitlich zu therapieren, wurde spätestens durch die Arbeiten von Bert Vogelstein in Frage gestellt. Stattdessen setzt sich immer mehr die Vorstellung durch, Proben auf DNA-Ebene zu unterscheiden und Patientensubpopulationen entsprechend zu stratifizieren.

Mit den Erkenntnissen der Molekularbiolo-gie – insbesondere über die Bedeutung von Signalkaskaden in Tumorzellen – konnte belegt werden, dass z.B. die für das Tumorverständ-nis und neue Therapieverfahren wichtigen Phosphoproteine bei der Probeentnahme sehr schnell großen Veränderungen ausge-setzt sind. Um also eine Probe zu gewinnen, die die Tumorbiologie im Körper abbildet, ist ein vierter Typ von Qualitätsbetrachtung wichtig – die Nähe zur molekularen Realität im Patienten. Dabei ist der Vorgang, mit dem die Probe gewonnen wird, für die Qualität entscheidend: Nur eine sehr schnell fixierte Probe kann die molekulare Realität einfangen und somit eine hohe Qualität gewährleisten. Bei der Probenahme per Biopsie oder OP ist die Dokumentation der Geschwindigkeit, des Ablaufes und von Randbedingungen, wie intra-operativer Ischämiezeiten, Anästhesiedauer und Art der Medikation, wichtig.

Relevante Assays

Ein Beispiel für die Bedeutung genetischer Veränderungen für Therapieentscheidungen ist die Bestimmung von EGFR-Mutationen bei der Behandlung von nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom mit Erlotinib (Tarceva), ein

Lange Zeit wurden bei biologischen Proben ausschließlich physikalische Merkmale her-angezogen, um die Qualität einer Probe zu beurteilen – neben Angaben zum Spender zum Beispiel die Größe, das Gewicht und die Lokalisation der einzelnen Probe. Auch das Medium oder die Methode, mit der die Probe konserviert wurde, wurde als wichtiges Qua-litätsmerkmal betrachtet.

Als zweite Qualitätsdimension kamen die klinischen Daten hinzu. Nach und nach wurde

Alle Produkte im Protein-Mi-croarray-Markt fokussieren sich derzeit auf hochaffine Interak-tionen von Proteinen mit kor-

Abb. 1: Nur gut phänotypisierte, dokumentierte und reproduzierbare Proben haben Wert für die klinische Forschung.

Abb.2: Qualitätsmerkmal Lagerung. Um die Probenintegrität zu erhalten, gilt es möglichst schnell und schonend ein-zufrieren und zu lagern.

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Blitzlicht Probenvorbereitung

weiteres die Analyse des K-Ras-Status bei der Behandlung von kolorektalen Karzinomen mit Cetuximab (Erbitux). Auch die Bestimmung der Zahl der Her-2-Genkopien bei der Behandlung von Brustkrebs mit Trastuzumab (Herceptin) und die Analyse von BCR-Abl-Translokationen (Philadelphia-Chromosom) für die Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie mit Imatinib (Gleevec) sind wichtige genetische Biomarker.

Darüber hinaus werden heutzutage viele andere Untersuchungsmethoden wie etwa die Proteomanalyse, die genomische Analyse von Mutationen, Genvarianten, der DNA-Methylie-rung und Genexpression sowie Gewebeanalyse mittels IHC/Histopathologie eingesetzt, um therapierelevante Moleküle und Biomarker (z.B. Her-2-Expressionsstatus bei der Brustkrebs-behandlung mit Trastuzumab/Herceptin) zu identifizieren und zu charakterisieren. Speziell Proteine, Phosphoproteine und RNA-Moleküle werden oft sehr durch äußere Faktoren beein-flusst. Die Kontrolle dieser externen Faktoren bzw. Qualität der klinischen Proben ist daher für eine aussagekräftige Analyse essentiell.

Erweiterte Modelle

Bis jetzt wurde die Probe als direktes Untersu-chungsobjekt diskutiert. Auch bei Labormodel-len, in denen die Probe zum Beispiel zu einer Zellkultur veredelt wird, sind Qualitätsmerk-male entscheidend. Wissen über molekulare Veränderungen und Varianten in menschlichen Zellen sowie die Kenntnisse über DNA-Verände-rungen als Ursache für Erkrankungen bringen auch neuartige Modellansätze hervor. Bisher dienen Zellkulturen neben den klassischen Tierversuchen zur Testung von Therapiekandi-daten auf Toxizität und Wirksamkeit. Bei diesen

Versuchen reicht es oft nicht, die Qualität zu kennen. Es werden in vielen Fällen spezielle Qualitätsmerkmale benötigt, um überhaupt den Versuch durchführen zu können.

Moderne Modellsysteme nutzen etwa die in vitro-/ex vivo-Testung kultivierter Tumorzellen oder kultivierter frischer Tumorgewebsschnit-te (3D-Modellsystem). Speziell die Testung von frisch resezierten Tumorgeweben im Kontext von Nichttumorzellen (zum Beispiel Bindegewebs zellen) ermöglicht eine Analytik tumorrelevanter Signalwege in einem Testsys-tem, das der molekularen Realität im Patienten nahekommt. Entscheidend ist hier wiederum, dass das zu testende Gewebe möglichst schnell nach der Probenentnahme im OP – idealer-weise noch während der Operation – in Kultur genommen wird, damit – soweit möglich – ex-terne Faktoren ausgeschlossen werden, die den natürlichen Zustand des Gewebes verändern (Temperaturschwankungen, Sauerstoffent-zug, Mangel an erforderlichen Nährstoffen, etc.). Wie bei der Analytik von gefrorenen oder fixierten Gewebeproben sollte auch in diesen Modellsystemen eine ausführliche Dokumen-tation der relevanten klinischen Daten der Patienten die Gewebetestung begleiten, damit therapierelevante Faktoren identifiziert werden und in die Gesamtbeurteilung der experimen-tellen Ergebnisse mit einfließen können.

Ethische/regulatorische Faktoren

Eine ethisch korrekte und gesetzeskonforme Gewinnung von Gewebeproben ist im Grun-de auch ein Qualitätsmerkmal, geht es doch

letztlich um das Ausmaß an Information, das einer Probe zugeordnet werden darf. Die Gesetze geben Hinweise für den Prozess der Probengewinnung und Lagerung, insbesonde-re aber darüber, wieviel und auf welche Weise persönliche Information der Probe zugeordnet und gespeichert werden darf. Nur durch ein komplettes Verblinden und damit verbundene Reduzierung der klinischen Daten einer Probe auf ein Minimum kann Material verwendet werden, für das kein Einverständnis vom Pa-tienten eingeholt worden ist. Dies ermöglicht die Verwendung von Proben die zum Beispiel aus Pathologieinstituten zur Verfügung ge-stellt werden können, was für einige Assays auch genügen kann. Eine Proben- und Daten-sammlung, der der Donor schriftlich zuge-stimmt hat, bildet die Basis für eine sehr hohe Qualität nicht nur bezüglich der physikalischen und molekularen Eigenschaften der Probe, sondern auch in Bezug auf die dazugehörigen klinischen Daten. Diese Qualitätsanforderun-gen gelten heute für die meisten präklinischen und klinischen Studien der pharmazeutischen Forschung.


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Abb. 3: Eine immunohistochemische Färbung von pmTOR in Dickdarmgewebe – zunehmend wichtig für Therapieentscheidungen bei Krebs

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Blitzlicht Antikörperoptimierung

Protein-Microarrays – Produktion, Qualität und AnwendungenDr. Stefan Müllner, Protagen AG, Dortmund

Die Entwicklungen im Rahmen der ersten Genomprojekte führten mit Beginn der neunziger Jahre zu aus heutiger Sicht schier unglaublich erscheinenden Investitionen in Genomicsfirmen und projekte. Getrieben wurde die Dynamik durch den Wunsch der Pharmazeutischen Industrie, durch Automation und Hochdurchsatzscreening schneller spezifischere, sprich besser verträgliche Wirkstoffe zu finden, insbesondere zur Behandlung von Krebs. Die Überzeugung vieler Investoren und Pharmamanager, die damals boomende, renditeträchtige ComputerchipIndustrie dauerhaft mit den hochprofitabel erscheinenden Life Sciences verknüpfen zu können, trübte jedoch ihren Blick auf die sehr verschiedenen Entwicklungszeiten in den beiden Sektoren – und damit auf die Risiken und den daraus resultierenden Finanzierungsbedarf. Während die Hard und Softwareprodukte sich rasch entwickeln ließen und den Markt schnell erreichten, konnte die Wirkstoffentwicklung, welche im günstigsten Fall 10 Jahre Entwicklungszeit und Investitionen von mehreren hundert Mio. Euro bis zum Produkt benötigt, nicht signifikant beschleunigt werden. Heute gehören DNAMicroarrays zum Routinewerkzeug in der Forschung, vor allem im Hinblick auf die differentielle Genexpressionsanalyse. Die UNIchip® Protein Microarrays werden dagegen in der Entwicklung von Biotherapeutika, insbesondere monoklonaler Antikörper, eingesetzt und ermöglichen dort ein stringentes Ranking potentieller Kandidaten anhand ihrer OffTargetEffekte.

Als Affymetrix und einige andere Firmen 1994 begannen, die damals noch Chips genannten DNA-Microarrays zu vermarkten, war die Stim-mung des Kapitalmarktes gut und die Akzep-tanz hoch – die Pharmaindustrie schwärmte von den attraktiven Möglichkeiten zur Entwicklung völlig neuer Therapieansätze.

Schon zu dieser Zeit wurde auch der Ruf nach Protein-Microarrays laut. Zwar war das Potential möglicher Anwendungen noch nicht ausgelotet. Doch war der Schritt, neben den Gensequenzen auch die von ihnen codierten biologischen Funktionsträger im Microarray-Format verfügbar zu machen, logisch und im Prinzip auch bereits damals machbar. Im Gegen-satz zu den DNA-Microarrays ist die Herstellung reproduzierbarer und funktionsfähiger Protein-Microarrays technisch aber die wesentlich größere Herausforderung. Dies liegt vor allem an den physikochemischen Eigenschaften der Proteine. Während sich DNA aufgrund ihres sehr einfachen Aufbaus aus nur vier chemisch sehr ähnlichen Bausteinen unabhängig von der jeweiligen Sequenz immer auch sehr ähnlich hinsichtlich Löslichkeit, Stabilität, Bindung etc. verhält und die DNA-Raumstruktur unter Hybridisierungsbedingungen praktisch keine Rolle spielt, müssen bei der Entwicklung, Pro-duktion und Nutzung von Protein-Microarrays zahlreiche zusätzliche Parameter berücksichtigt werden. Zugespitzt lässt sich sagen, dass sich

Alle Produkte im Protein-Mi-croarray-Markt fokussieren sich derzeit auf hochaffine Interak-tionen von Proteinen mit kor-

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jedes Protein individuell verhält und dass es praktisch nicht zwei Proteine gibt, die ein gleiches Molekulargewicht, den gleichen iso-elektischen Punkt und eine übereinstimmende Faltung und Löslichkeit zeigen. Dazu kommt, dass Proteine durch intramolekulare Wasser-stoffbrückenbindungen und intramolekular gebundenes Wasser in ihrer Raumstruktur sta-bilisiert werden.

Geht es bei funktionellen DNA-Microarrays lediglich darum, DNA-Sequenzen auf eine Oberfläche zu synthetisieren, um ihre Hyb-ridisierung mit komplementären DNA- oder Oligonukleotid-Strängen zu ermöglichen, muss bei Protein-Microarrays ein Weg gefunden wer-den, möglichst viele individuelle Eigenschaften der verwendeten Proteine zu erhalten.

Chipoberflächen im Fokus

Im Zuge der Entwicklung von Protein-Micro-arrays fokussierten sich zahlreiche Unter-nehmen zunächst auf die Entwicklung einer speziellen und aufwendigen Oberflächen-Derivatisierungschemie. Die dazu eingesetz-ten Biotin-Streptavidin-, Expoxid- oder Thiol-aktivierten Linker oder Dendrimere dienten vor allem dem Zweck, die Proteine unter Erhaltung ihrer Funktion und Raumstruktur gerichtetet auf dem Trägermaterial zu fixieren. Wenig berücksichtigt blieb dabei zunächst, dass die Faltung und Aktivität von Proteinen bei ge-gebenem pH und Ionenkonzentration immer auch von thermodynamischen Freiheitsgraden abhängt, was die Auswahl der zu fixierenden Proteine erheblich einschränkt – Arrays mit kor-

rekt gefalteten und funktionsfähigen Proteinen sind dadurch nur mit sehr ähnlichen Molekülen möglich, wie etwa Antikörpern. Neben dieser grundsätzlichen Problematik hat auch die Natur der Oberfläche, auf die die Proteine aufgebracht werden, einen erheblichen Einfluss auf die spä-teren Nutzungsmöglichkeiten. Da sich Proteine prinzipiell an sehr verschiedene Materialien wie Glas-, Plastik- oder Metall binden lassen, richtet sich die Auswahl der geeigneten Oberfläche und des Protein-Druckverfahrens für einen Array da-nach, was aus Anwendersicht erforderlich ist. In jedem Falle müssen die Haltbarkeit des Arrays und Reproduzierbarkeit des durchzuführenden Assays durch eine hohe Qualität des Druckpro-zesses mit möglichst niedriger Intrachip- und Interchipvarianz sichergestellt sein.

Nitrozellulose-Oberflächen

Diese Kriterien erfüllen in geradezu idealer Weise Nitrozellulose -Oberflächen, die sich als Film auf („gecoatete“) Glas-Objektträger auf-bringen lassen. Besonders geeignet erscheinen Nitrozelluloseoberflächen für den Einsatz auf Protein-Microarrays aus zwei Gründen: I Das Trägermaterial hat sich als Support

in proteinbasierten diagnostischen Tests bereits bewährt. Dementsprechend kann auf langjährige Erfahrungen hinsichtlich der Haltbarkeit solcher Träger und ihrer reproduzierbaren Herstellung zurückge-griffen werden.

I Zahlreiche Publikationen belegen, dass sich Proteine auf Nitrozellulose messbar renaturieren und in funktioneller Form vor-liegen, wie Messungen der Enzymaktivität zeigen.

Die dreidimensionale Porenstruktur und Porengröße der Nitrozellulose sowie deren

physikochemische Eigenschaften sind dabei sowohl für die Protein-bindenden als auch die Protein-stabilisierenden Eigenschaften entscheidend. Wahrscheinlich ersetzen die Nitrogruppen in der Schwammstruktur des Substrats das intramolekulare und zur Protein stabilisierung notwendige Wasser.

UNIchip® Protein Microarrays

Protagen nutzt Nitrozellulose als Trägermaterial für seine UNIchip® Protein Microarrays, die zur Bestimmung der Spezifität von therapeuti-schen Antikörpern und Protein-Bindern in der präklinischen Entwicklung eingesetzt werden. Die Arrays, auf denen sich neben dem in einer Verdünnungsreihe gedruckten Target-Antigen 400 ausgewählte Proteine befinden, werden dazu in Tecan®-Hybridisierstationen mit einer 200µl Lösung eines Test-Antikörpers inkubiert (und ein quantitativer Fingerabdruck des Bin-dungsverhaltens des zu untersuchenden Anti-körpers/Proteinbinders erfasst). Die Puffer-und Inkubationsbedingungen sind dabei so gewählt, dass sich die auf die Nitrozellulose -Oberfläche gespotteten Proteine spontan in ihre natürliche Konformation zurückfalten können.

Anwendung

Mit den UNIchip® Protein Microarrays lassen sich Antikörper und andere hochaffine Protein-

Abb.2: GrundlagefürdasBedruckenderUNIchip®ProteinMicroarraysisteineTechnologie,welcheamMax-Planck-InstitutfürmolekulareGenetikent-wickeltundvorelfJahrenvonProta-geneinlizenziertwurde.SiebildetdieBasisfürdieExpressionsbibliotheken,mitdenenProtagenderzeitrund10.000unterschiedlichehumanePro-teineinE.coliexprimierenkann.www.laborwelt.de

Abb.1: Nitrozellulose-beschichteteUNIchip®ProteinMicroarrays.DieProteinarrayseignensichfürdieparalleleUntersuchungvonAntikörper-Antigen-,Protein-Protein-sowieProtein-Medikament-Wechselwirkungen.




binder hinsichtlich ihrer Off-Target-Aktivität kategorisieren. Bereits mit Markteinführung der UNIchip® Protein Microarrays im Jahr 2005 hat Novartis diese eingesetzt, um die besten Antikörper-Kandidaten für die Präklinik auszuwählen. An diesem Punkt in der Antikörperentwicklung muss meist aus einer Gruppe von fünf bis zehn Antikörperkandidaten, die sich hinsichtlich ihrer Affinität zum Target und biologischen Aktivität kaum unterscheiden, eine zuverlässige Auswahl getroffen werden. Die Anzahl der gemessenen Off-Target-Aktivitäten ermöglicht nicht nur diese Selektion, sondern gibt auch einen wichtigen Hinweis auf die zu erwartende Pharmakokinetik des Moleküls. Die UNIchip® Technologie wird heute von insgesamt etwa 20 Firmen, davon drei der Top 20- Phar-mafirmen, mit dem gleichen Ziel genutzt.

Voraussetzung für die Entwicklung der UNIchip® Technologie war der direkte Zugang zu Protein-Expressionsbibliotheken und zu einem leis-tungsfähigen Produktionsprozess. Während für die Herstellung der 100 bis 200 Protein-Microarrays nur recht geringe Menge des jeweiligen Proteins – zwischen 50 und 100µg – gebraucht werden, sind die Anforderungen an die Reproduzierbarkeit des Prozesses und der Expressionsleistung beziehungsweise Proteinausbeute sehr hoch.

Um die bereits im Jahr 2000 von der Max-Planck-Gesellschaft ein-lizenzierte und erfolgreich zur Protagen transferierte Technologie zur Herstellung und Nutzung von Protein-Expressionsbibliotheken bis zur Produktionsreife weiterzuentwickeln, war insbesondere die Optimierung und Standardisierung der Arbeitsabläufe sowie ein stringentes Qualitäts-management für den gesamten Prozess von I Library-Generation und Management I Optimierung der Kultivierungsbedingungen im Multititerplattenfor-

matI Hochdurchsatzreinigung der His-TAG-Expressionsprodukte mit Ni-

NTA-BeadsI Reinheits-und Ausbeutebestimmung mit Kapillarelektrophorese I Protein-DruckprozessI InkubationI Read-out I Auswertung & Dateninterpretation erforderlich. Durch die eigenständige Entwicklung des gesamten Produktionsprozesses und Know-hows hinsichtlich der Anwendung und bioinformatischen Aus-wertung hat sich die Protagen AG als Technologieführer im Marktsegment der Protein-Microarrays etabliert. Die potentiellen Anwendungen der Arrays sind dabei deutlich vielfältiger, als die bloße Betrachtung typischer Antikörper/high affinity scaffold protein binder-Antigen-Interaktionen vermuten lässt.

Erscheinen Antikörper in der Theorie monospezifisch und stabil, so sieht die Realität doch anders aus. In der Praxis sind die meisten the-rapeutischen Antikörper eher „polyspezifisch“ – besonders die über rekombinante Technologien gefundenen Antikörper – und ihre jeweilige Spezifität verändert sich zudem unter Stressbedingungen (Temperatur, UV, Gefrier-Auftau-Zyklen, Lagerung etc.). Diese molekülspezifischen Veränderungen lassen sich durch den Einsatz von UNIchip® Protein Microarrays feststellen und quantifizieren. Wichtig für die Qualitätskon-trolle bei der Antikörper-Produktion: Auch lassen sich durch Downstream Processing induzierte physikochemische Veränderungen am Antikörper-Molekül durch eine quantitative Veränderung des Off-Target-Profils auf den Protein-Microarrays feststellen.


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Blitzlicht Konferenzreport

Synthetische Biologie: Immenser Fortschritt in der Signalling-ForschungDr. Tilman Brummer, BIOSS; Raphael Gübeli, SGBM; Prof. Dr. Wilfried Weber, BIOSS Freiburg

Obwohl sich die Zahl der wissenschaftlichen Publikationen zur Synthetischen Biologie der-zeit alle 20 Monate verdoppelt, haben die meisten Europäer (durchschnittlich 83 %) laut der jüngsten Eurobarometer-Umfrage noch nie von dem dynamischen Forschungsgebiet gehört. Zugleich dokumentiert die repräsentative EU-Umfrage zur Biotechnologie, dass sich die Deutschen besonders für die Chancen und Anwendungen des Neudesigns biologischer Systeme interessieren: 62% fragen zuallererst nach dem Nutzen von synthetischen Bakteri-en mit neuartigen Eigenschaften, zellulären Schaltern oder genetischen Regelkreisen – gut 10% mehr als im EU-Durchschnitt. Erst dann wollen sie mehr über die potentiellen Risiken erfahren. Aufklärung über den aktuellen Stand der Forschung bot Ende September 2010 das erstmals ausgerichtete internationale Symposium „Signalling meets Synthetic Biology“. Auf der vom Freiburger Cluster BIOSS (Centre for Biological Sigalling Studies) organisierten und mit 230 Wissenschaftlern gut besuchten Konferenz wurde klar: Vom Design vollständig künstlicher Mikroorganismen sind die Forscher trotz anderslautender Medienberichte noch Jahre entfernt. Doch auf einem anderen Gebiet berichten verschiedene Gruppen bereits von Fortschritten und ersten Anwendungen – der gezielte Eingriff in die Zellkommunikation durch das Neudesign zellulärer Schalter, Signalwege und Regelkreise eröffnet die Möglichkeit, Krankheitsmechanismen und deren Modulation nachzustellen und so das Drug Discovery zu verbessern. Diese Signalforschungs-orientierte Synthetische Biologie hatten die Organisatoren um BIOSS-Direktor Michael Reth getreu dem Leitmotto „From Analysis to Synthesis“ in das Zentrum des zweitägigen Symposiums gestellt.

Systeme. Durch in vitro rekonstruierte Systeme lassen sich fundamentale biologische Prozesse immer besser quantitativ beschreiben und mo-dellieren, erläuterte Petra Schwille (TU Dresden) in ihrem Vortrag. Als Beispiel nannte die Leibniz-Preisträgerin die Rekonstruktion der Zellteilung von E. coli mittels eines in vitro-Assays. Mit Hilfe der zwei Proteine MinD und MinE, einer Membran und einer Energiequelle gelang es,

die Mechanismen der Selbstorganisation aufzu-klären, die dazu führen, dass sich die Mutterzelle symmetrisch in zwei Tochterzellen teilt.

Synthetische Schalter

Wieviel Anwendungspotential im Design und der Konstruktion von neuartigen synthetischen Schaltmechanismen und Regelkreisen liegt, zeigte sich in den Arbeiten, die Jeff Tabor (Rice University Houston), Christina Smolke (Stanford University), Martin Fussenegger (ETH Zürich) und Wilfried Weber (Universität Freiburg) in Freiburg vorstellten.

Martin Fussenegger berichtete über die erst-malige Anwendung eines synthetischen Regel-kreises mit medizinischem Nutzen in Säugetie-ren. Dazu hatte der Forscher genetische Schalt-kreise in gichtkranke Mäuse implantiert, die ein engineertes bakterielles Regulationssystem kodieren, das die zu hohen Harnsäurekonzent-rationen im Blut der Nager erkennt, daraufhin das Enzym Uratoxidase exprimiert und so die Konzentration des gichtinduzierenden Meta-boliten auf physiologische Blutkonzentrationen senkt. Das patentierte Prinzip, pathologisch hohe Konzentrationen von Metaboliten mit Hilfe des Transkriptionsrepressor/-Operatorpaares HucR/hucO und nachgeschalteten katabolen Enzymen zu regulieren, sieht Fussenegger als Weiterentwicklung der Gentherapie.

Einen medizinisch vielversprechenden Ansatz präsentierte Christina Smolke auf dem BIOSS-Meeting: modular aufgebaute Riboschalter, die aus drei Teilen bestehen – einer Sensor-RNA, an die Medikamente oder von kranken Zellen überexprimierte Moleküle binden, einer RNA, die daraufhin ihre Konformation ändert (oder differentiell gespleißt wird) und dadurch eine Effektor-RNA freigibt, die gewünschte Zellant-worten induziert. Mit dieser Strategie gelang es Smolke bereits, die Vermehrung primärer T-Zellen und damit die Immunantwort in Mäusen abhän-gig von der Konzentration eines externen Ligan-den zu kontrollieren. Ein großer Schritt auf dem Weg, die endogenen, von Krebszellen bevorzugt gebildeten Proteine zu deren Wachstumsarrest und Vernichtung zu nutzen, ist Smolke ebenfalls geglückt. Ein Aptamer, das erstmals die Expres-sion eines Suizidgens mit der Anwesenheit der endogenen Proteine b-Catenin und NFkB verknüpft, stellte Smolke unlängst vor.

Jeff Tabor präsentierte lichtgesteuerte Sig-nalelemente in E. coli, die als Edge-Detektor die Grenze zwischen Hell und Dunkel erkennen oder die es erlauben, abhängig von der eingestrahlten Lichtfarbe ortsspezifisch und differentiell die Expression einzelner Gene zu aktivieren.

Synthetische Schaltkreise halfen laut Wil-fried Weber, der 2008 gemeinsam mit Martin Fussenegger die Firma BioVersys gegründet hatte, auch einen neuen Wirkstoff zu entde-cken, der die Resistenz des Tuberkuloseerregers Mycobacterium tuberculosis gegenüber dem Antibiotikum Ethionamid aufhebt. Das Scree-

Während das gesamtgenomische Engineering ganzer Mikroorganismen laut Drew Andy (Stan-ford University) „erst in sechs bis zehn Jahren“ möglich sein wird, wenn verbesserte Methoden der DNA-Synthese, mehr standardisierte biolo-gische Teile (Biobricks) und interne Referenz-größen zur Verfügung stehen, zeigt sich bereits zunehmend der Nutzen des synthetischen Nachbaus minimaler definierter biologischer

In dem im Herbst 2007 von der Deutschen For-schungsgemeinschaft bewilligten Exzellenz-cluster BIOSS arbeiten derzeit die Labors von 34 Professoren und weiter 30 assoziierte Labors. Neben der Analyse und dem Nachbau bzw. Design biologischer Signalprozesse schreibt das Freiburger Cluster die Nachwuchs- und Frauenförderung groß. Dafür sorgen u.a. eine enge Zusammenarbeit mit der Spemann-Graduiertenschule für Biologie und Medizin (SGBM) sowie eine paritätische Besetzung der W3-Professuren mit Frauen und Männern. Neben der Ausbildung junger Bioingenieure stehen Interdisziplinarität und Öffentlichkeits-arbeit weit oben auf der BIOSS-Agenda.


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Abb. 1: BIOSS‘s intern (v. links): Rektor Hans-Jochen Schiewer, der wissenschaftliche BIOSS-Direktor Michael Reth und Wilfried Weber

ning einer Molekülbibliothek gegen ein in vitro-System, das die Bindung des von resisten-ten Bakterien gebildeten Repressors (EthR) an einen Operator nachstellt, der die Expression der Ethionamid-spaltenden Flavinmonooxygenase EtaA reguliert, lieferte den präklinischen Arznei-mittelkandidaten BV6481.

Künstliche Stammzellnischen

Wie über synthetische extrazelluläre Matrices das Wachstum und die Differenzierung von Stammzellen gesteuert werden können, berich-teten Helen Blau (Stanford University), Prasad Shastri (Universität Freiburg), Matthias Lutolf (EPFL Lausanne) sowie Noortje Kornet aus der Arbeitsgruppe Thomas Laux (Universität Frei-burg). Während Noortje Kornet die Funktion und Bedeutung der natürlichen Stammzellnische für die Entwicklung von Arabidopsis darstellte,

beschrieben Shastri, Blau und Lutolf Ansätze, wie sich über synthetische Nischen die Zellfunktion steuern lässt.

Shastri stellte in diesem Zusammenhang eine Methode zur in vivo-Knorpelregeneration in ei-ner Alginat-Matrix dar, die ohne Transplantation auskommt. Nach Shastris Ergebnissen spielen die physiko-chemischen Eigenschaften der zur Differenzierung pluripotenter Stammzellen und Geweberegenration eingesetzten Biomateriali-en in vivo auf noch unverstandene Weise eine viel größere Rolle als die zur in vitro-Differenzie-rung vielgenutzten Wachstumsfaktoren.

Helen Blau berichtete, dass sich durch eine künstliche Stammzellnische, die in Zellkultur schnell schwindende Regenerationsfähigkeit adulter gewebespezifischer Stammzellen aber auch in vitro aufrechterhalten lässt. Durch Einsatz eines elastischen Hydrogel-Substats sowie von extrazellulären Nischenfaktoren gelang es ihrer Gruppe, Muskelstammzellen

zu kultivieren, die in Kultur nicht ihre Rege-nerationsfähigkeit einbüßen, ein in Kultur bisher stets auftretendes Problem. Nach Transplantation in Mäuse wies Blau mit auto-matisierten bilderkennenden Verfahren nach, dass die Zellen sich selbst erneuerten und signifikant zur Muskelregeneration beitrugen. Dies stützt die These, dass sich die Entwicklung von Stammzellen auch mit Hilfe geeigneter Biomaterialien steuern lässt.

Matthias Lutolf zeigte auf, wie durch den Einsatz von Mikrosystemtechnik und auto-matisierter Einzellzellanalyse Stammzellen im Hochdurchsatzverfahren kultiviert und charakterisiert werden können mit dem Ziel, optimale Kultivationsbedingungen für adulte Stammzellen zu entwickeln.

Analyse von Signalwegen

Vor der gezielten Manipulation krankheits-relevanter Signalketten steht naturgemäß deren Analyse und die Identifikation geeig-neter Subsysteme für das Rebuilding. Denn die Dynamik der komplexen Signalprozesse ist bisher weitgehend unverstanden. Ent-sprechende Vorträge nahmen einen großen Raum des Symposiums ein. Chris Marshall (Institute of Cancer Research, London), Walter Kolch (University College Dublin) und Tilman Brummer (Universität Freiburg) stellten in ihren Präsentationen neueste Ergebnisse zu MAPK-Signalwegen und kleinen G-Proteinen vor, die eine Rolle in der Tumorproliferation bzw. Zellmi-gration spielen. MAPK-Signalwege stellten die ersten Signalwege in eukaryotischen Zellen dar, deren Grundkomponenten und hierarchische Ordnung aufgeklärt wurde. Aufgrund des gu-ten Verständnisses dieser Signalwege werden sie bereits zur mathematischen Modellierung

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Doktoranden mit eigenem Vortragsprogramm

herangezogen. Mit Hilfe von Proteomanalysen sowie der RNA-Interferenz wurden zudem neue Erkenntnisse zur Feinregulation der Effektor-funktionen dieser Signalwege sowie zur Rolle der kleinen G-Proteine bei der Zellmigration vorgestellt

Erst unlängst entdeckte, transient gebildete Strukturen auf der Zelloberfläche invasiver Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der physiologi-schen und pathologischen Zellwanderung, etwa der Metastasierung von Tumorzellen. Nachdem die Gruppe von Sara Courtneidge (Burnham Institute, La Jolla) bereits ein Protein (Tsk4) und Komponenten eines Pathways in glatten Mus-kelzellen (PDGF-Rezeptor, Src, p53 und die regu-latorischen mi RNAs miR143, miR145) identifiziert hatte, die zur Bildung dieser Podosomen und Invadopodien benötigt werden, stellte sie in Frei-burg einen zellbasierten Assay vor, mit dem sich automatisiert Aktivatoren und Inhibitoren der Podosomen/Invadopodien-Bildung identifizie-ren lassen. Ziel der laufenden Forschungsarbeit ist es, genau zu verstehen, wie die identifizierten niedermolekularen Inhibitoren und siRNAs auf die Kompomenten des Signalweges wirken, um diese modulieren zu können.

Yinon Ben-Neriah (Hebrew University-Ha-dassah Medical School, Jerusalem) präsentierte daneben neue genetische Ansätze, die einen besseren Einblick in das Wechselspiel zwischen Entzündungsprozessen und Tumorentwicklung

geben. Giulio Superti-Furga (CeMM, Wien) gab einen Überblick über die neuesten Erkenntnisse hinsichtlich des Multiproteinkomplexes, der von dem Treiber der chronisch-myeloischen Leukä-mie, dem Bcr-Abl-Onkoprotein, in Tumorzellen aufgebaut wird. Diese Proteomik-basierten Stu-dien bilden möglicherweise die Basis für neue Therapie-Ansätze. Chris Meisinger (Freiburg) berichtete zudem, inwieweit zytoplasmatische Signalwege durch die Phosphorylierung von Proteinen diverse Prozesse in Mitochondrien steuern, während Klaus Palme (Freiburg) neue Erkenntnisse zu den Signal-Prozessen in der Entwicklung von Pflanzenwurzeln vortrug.

Eine Reihe weiterer Vorträge drehte sich um die Analyse der Signaltransduktion bei der Ak-tivierung von T- und B-Zellen. Doreen Cantrell (University of Dundee) stellte dar, wie sich mit einem Proteomik-Ansatz das von Serin/Threoninkinasen kontrollierte Signalnetzwerk in T-Lymphozyten untersuchen lässt, André Veillette (Clinical Research Institute, Montreal) berichtete über neueste Forschungsergebnisse zu Adaptorproteinen in T-Lymphozyten. Wäh-rend Johannes Huppa (Stanford) und Wolfgang Schamel (Freiburg) über den Zusammenbau und die Funktion von T-Zell-Antigenrezeptoren vortrugen, berichtete Sebastian Herzog (Frei-burg) über die delikate Balance zwischen Proliferation und Differenzierung in der frühen Entwicklung der B-Lymphozyten. Obgleich die

Laborwelt Bildkasten

Einen eigenen Vortragsstrang sowie die Pos-tersession der Tagung hatten die Doktoranden der „Spemann Graduiertenschule für Biologie und Medizin (SGBM)” organisiert.

Dass durch Anwendung des Wissens, wie ein metabolisches Enzym im Laufe der Evolution seine Funktion anpasst, völlig neue syntheti-sche Stoffgruppen oder Proteine entwickelt werden können, zeigte darin Joseph Noel (Salk Institute, La Jolla) anhand pflanzlicher Polyketid-Enzyme.

Yolanda Carrasco (CNB/CSIC Madrid) ver-anschaulichte das Zusammenspiel von Che-mokin- und B-Zell-Rezeptoren während der

Aktivierung naiver B-Zellen zu Beginn einer Immunantwort sowie deren Auswirkungen auf die weitere B-Zell-Entwicklung.

Nancy Hynes (Friedrich Miescher Institut, Basel) zeigte, dass durch gezielte Hemmung von Rezeptor-Tyrosinkinasen, Brustkrebs er-folgreich bekämpft werden kann.

Victor de Lorenzo (CNB/CSIC Madrid) erläuterte, warum im Labor gezüchtete Mik-roorganismen für Anwendungen der Umwelt-biotechnologie in der freien Natur oft kläglich scheitern und wie sich in Bakterien ablaufende metabolische Prozesse auf einfache und ele-gante Art simulieren lassen.

vorgestellten Feinanalysen des Immunsignal-lings auf den ersten Blick zunächst recht wenig mit der Synthetischen Biologie zu tun zu haben scheinen, legen sie wichtige Grundlagen für das künstliche Rebuilding definierter Teilsysteme der Immunfunktion, das überraschende und höchst praxisrelevante Ergebnisse bereit halten kann. Ein solches präsentierte BIOSS-Sprecher Michael Reth zwar nicht auf der Tagung, aber in einer zeitgleich zu dieser erschienenen Pu-blikation (Nature, 2010 Sep 23; 467(7314):465-9). Durch Zusammenbau und Funktionalisierung künstlicher B-Zellrezeptoren in Drosophila konnte er das bisherige Paradigma der Rezeptor-aktivierung widerlegen: Die Antigenbindung an B-Zellrezeptoren führt, wie Reths Gruppe zeigen konnte, nicht zur Zusammenlagerung einzelner Rezeptoren in ruhenden Zellen, sondern zur Dis-soziation von in ruhenden Zellen vorhandenen Rezeptor oligomeren. Bestätigt sich das neue Dissoziations-Aktivierungsmodell der Antikö-perbildung, ergeben sich neue pharmakologi-sche Angriffspunkte in ruhenden B-Zellen.

Redesign von Signalwegen

Die bakterielle Chemotaxis ist einer der bestcha-rakterisiertesten Signalwege. Nachdem Victor Sourjik (Heidelberg) die direkte und indirekte Aktivierung der beteiligten Rezeptorproteine quantitativ erfasst hatte, zeigte er, wie das Wis-sen für ein Redesign des Chemotaxis-Pathways in E. coli im Sinne der synthetischen Biologie eingesetzt werden kann. Ziel der in zahlreichen Labors laufenden Versuche, die Spezifität und den Output des Signalweges zu modifizieren, ist die Entwicklung neuer Biosensoren.

Wie sich Komponenten prokaryotischer und eukaryotischer Signalketten in Pflanzen zu synthetischen Biosensoren mit verändertem Output sowie Aktivierungssignalen vernetzen (rewire) lassen, demonstrierte June Medford (Colorado State University) in einem eindrucks-vollen Vortrag. Dabei machte sich die Forscherin zunutze, dass die Komponenten von Histidin-kinase (HK)-Transduktionssystemen sowohl in Bakterien, Hefen als auch Pflanzen hochkonser-viert, modular aufgebaut und damit prinzipiell gegenseitig durch Phosphatgruppentransfer aktivierbar sind. Der von Medford neuverschal-tete Biosensor nutzt den in der Zellmembran der Pflanzen lokalisierten eukaryotischen HK-Rezep-tor, um nach dessen Aktivierung durch Zytokinin das modifizierte bakterielle Response Regulator-Protein PhoB-VP64 zu aktivieren. Dieses bindet im Pflanzenzellkern an einen synthetischen pflanzlichen Pho-Promotor, der die Expression nachgeschalteter Gene aktiviert. Die Pflanzen können laut Medford bei optisch messbarem Output als Biosensoren für Substanzen in der Umwelt genutzt werden.

Auf der Tagung wurde Maria Karlsson mit dem mit 10.000 Euro dotierten Barbara-Hobom-Preis ausgezeichnet. Preise für die besten Poster erhielten Alexander Lang und Almut Dufner.



Branche Labormarkt im Umbruch

Mit der 6,8 Mrd. US-$ schweren Übernahme von Beckman Coulter durch den Danaher-Konzern haben die Laborzulieferer wieder einmal für Schlagzeilen gesorgt. Grund genug, in dieser LABORWELT-Serie einen Blick auf den Deal zu werfen. Mit dem Technologie-Konzern Dana-her betritt erneut ein nicht-spezialisierter Player die Life Sciences-Bühne. Ob sich daraus ein ähnliches Erweckungserlebnis entwickelt, wie es General Electric mit der Übernahme von Amersham hatte, muss sich zeigen. Klar ist: Elefantenhochzeiten bleiben an der Tagesord-nung. Die Preise blieben hoch, genauso wie die Wahrscheinlichkeit, dass der Labormarkt in zehn Jahren völlig anders aussehen wird als heute.

Beckman-Coulter: Danaher gewinnt BieterschlachtDr. Patrick Dieckhoff, BIOCOM AG

Nicht alles, was Arnold Beckman anfasste, war von Erfolg gekrönt. Die nicht verklumpende Tin-te zum Beispiel. Zu sehr belästigte der Geruch der zugesetzten Buttersäure die Kunden beim Schreiben. Im zweiten Anlauf klappte es dann doch mit der Pioniertat. Der Sohn bayerischer Einwanderer erfand das pH-Meter und löste da-mit eines der größten Probleme eines benach-barten Orangensaftherstellers – zu entscheiden, welche Früchte zur Saftherstellung oder nur zur Produktion billiger Chemikalien taugten. Die daraus entstandenen Sunkist-Limonaden werden noch heute weltweit verkauft – die Produkte von Beckman-Coulter ebenfalls. Daran dürfte auch die Übernahme durch die Danaher Corp. nichts ändern.

Breit aufgestelltes Konglomerat

Rund 13,2 Mrd. Us-$ erwirtschaftet der ameri-kanische Technologiekonzern Danaher weltweit mit Produkten in der Umwelt- und Messtechnik, in der Zahnmedizin sowie industriellen Anwen-dungen. Mit bekannten Marken wie Leica Micro-systems, AB Sciex oder Molecular Devices stam-

men bereits 2,3 Mrd. US-$ Umsatz aus den Life Sciences. Durch die Übernahme von Beckman Coulter wird sich dieser Wert auf rund 6 Mrd. US-$ fast verdreifachen. Beckman ist vor allem stark in den Bereichen Automation, Zentrifuga-tion, Elektrophorese oder Analyzern vertreten. Zum größten Teil finden sich die Produkte des Unternehmens aus dem kalifornischen Orange County in Kliniken oder Referenzlaboren, aber auch in der wissenschaftlichen Forschung etwa bei der Versorung mit Reagenzien.

Danaher will sich durch die Übernahme vor allem Wachstumsmärkte in der Diagnostik erschließen. Weltweit werde die Nachfrage nach präventiven und prädiktiven Tests steigen

– nicht zuletzt durch eine rapide alternde Welt-bevölkerung in den Industrieländern. Zudem lo-cken Kostensynergien in Höhe von rund 250 Mio. Euro, die Danaher-President & CEO Lawrence Culp Jr. mit Hilfe von Einsparungen zu heben gedenkt. Tatsächlich haben die traditionellen Marken von Beckman Coulter mit Problemen zu kämpfen. 2010 wäre der Umsatz sogar geschrumpft, wären da nicht die 2009 einge-kaufte und offenbar erfolgreiche Olympus-Diagnostikgerätesparte gewesen. Grund für die

Beckman Coulter in Zahlen:

Umsatz: 3,7 Mrd. US-$ (2009)Gewinn (EBITDA): 840 Mio. US-$Operative Marge: 12,8%

Mitarbeiter: 12.000

Danaher in Zahlen:

Umsatz: 13,2 Mrd. US-$Gewinn (EBITDA): 2,54 Mrd. US-$Operative Marge: 16,24%Mitarbeiter: 50.000

Das Angebot:

Übernahmepreis: 6,8 Mrd. US-$Übernahmepreis: 83,50 US-$ pro AktieSynergien: 250 Mio. US-$ pro Jahr

Probleme im Stammgeschäft war ein Statement der amerikanischen Zulassungsbehörde FDA, das den Konzern im Frühjahr 2010 erschütterte. Offenbar hatte Beckman Coulter Änderungen an einem sehr erfolgreichen Troponin-Test ohne Abstimmung mit der Zulassungsbehörde durch-geführt. Die reagierte prompt und verschickte einen „Warning Letter“, der das Unternehmen im Juli erreichte und zu einem Kurssturz von rund 30% führte. Vom Rückzug des erfolgrei-chen Tests auf Herzinfarkte (40% Marktanteil) erholte sich das Unternehmen nicht mehr. Im September musste Beckman-Chef Scott Garrett seinen Posten räumen. Gegen Ende des Jahres stellte sich das Unternehmen selbst zum Verkauf – zum ersten Mal seit langem stieg der Aktienkurs wieder. Offenbar waren neben dem letztlich erfolgeichen Danaher-Konzern auch noch eine Reihe von Finanzinvestoren mit

bekannten Namen wie Blackstone oder Carlyle interessiert. Letztlich waren Sie aber nicht in der Lage, das strategische Angebot von Danaher zu überbieten. Rechnet man die übernommenen Schulden mit ein, bezahlt Danaher 6,8 Mrd. US-$ und damit rund das Doppelte des Umsatzes oder das 8-fache des Jahresgewinns 2009 von rund 840 Mio. Euro.

Breit aufgestelltes Konglomerat

Beckman soll jetzt als eigenständige Marke un-ter dem Danaher-Dach weitergeführt werden. Einige der 12.000 Mitarbeiter haben bereits Erfahrung, wie es sich in einem so großen Konglomerat lebt. 1982 wurde Beckman schon einmal übernommen. Käufer war damals der Pharmakonzern SmithKline, Vorläufer der heutigen GSK, mit dem der Laborzulieferer zu SmithKline Beckman verschmolz. Sieben Jahre später – die Börse hatte den Geschmack an breit aufgestellten Konglomeraten verloren

– drehten die SmithKline Manager das Rad wieder zurück. Beckman wurde eigenständig zurück an die Börse gebracht und übernahm 1997 die Coulter Corp. Ironie der Geschichte: SmithKline suchte sich mit der Beecham plc kurze Zeit später einen neuen Partner mit ganz ähnlichem Namen.

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Marktübersicht: Mikroskopie


Ob zur automatisierten Erfassung der Read-outs zellbasierter Assays, für die Echtzeitüberwachung der Rezeptorinternalisierung, physiolo-gischer Veränderungen in der Zelle oder immunhistochemische Färbungen – die Mikrosopie tritt vielgestaltig in vielen Arbeitsbereichen der Life Sciences-Forschung in Erscheinung. LABORWELT hat die Hersteller nach ihren Produktinnovationen gefragt. Die Antworten der Optikex-perten und belastbare Informationen zu ihren neuen Systemen finden Sie in dieser Marktübersicht.

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6thInternationalMeetingStem Cell NetworkNorth Rhine-Westphalia

April 5 – 6, 2011Essen, Germany

– sessions in disease modeling, non-human primate pluripotent stem cells, transdifferenti-ation and hypoxia & metabolism

– lectures by John Dick, Thomas Graf, Juan Carlos Izpisua Belmonte, Erika Matunis, Andreas Trumpp and many more

– poster session

– company exhibition

– satellite symposia: bioinformatics; iPS in large animal models

Congress attendance is free of charge.

Please register at:www.congress.stemcells.nrw.de

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Blitzlicht Karrierewelt

Mit 32 Jahren leitet Michael Rossbach seit Januar das Office of Business Development des Genome Institute of Singapore. Bereits als Post-Doc hatte Rossbach zweieinhalb Jahre dort mit der Forschung an Stamm-zellen verbracht. Nach dem Studium der Biologie in Bonn (1998) und Sydney (2000), schloss Rossbach nach Rückkehr an die private Universität Witten/Herdecke (2001) sein Studium mit dem Diplom in Biochemie (2004) ab. Die Forschungsarbeiten an seiner Promotion führten den Biochemiker und Wirtschaftswissenschaftler (2001-2006) an die Harvard Medical School in Boston (2004-2006) und seine Post-Doc-Zeit nach Singapur (2006-2008). Hier ist Rossbach A/Prof. im Fachbereich Chemie (seit 2007) an der National University of Singapore und lehrt am German Institute of Science and Technology (GIST TUM Asia). Zuletzt arbeitete Rossbach am Institut für Rekon-struktive Neurobiologie der Universität Bonn (2009-2010) und war Business Deve-lopment Manager der LIFE&BRAIN GmbH. Rossbach arbeitet ferner als freier Berater in Health and Life Sciences und ist Partner mehrerer Biotech-Firmen.

In meiner neuen Aufgabe als Leiter des Busi-ness Development am Genome Institute of Singapore arbeite ich gezielt mit Pharma- und Biotech-Unternehmen sowie der Acadamia zusammen, um neue Wirkstoffe, Therapien und Diagnostika aus der akademischen Forschung in die Anwendung zu bringen. Die Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), zu der auch die biomedizinischen Forschungsins-titute und das Genome Institute of Singapore (GIS) am Biopolis Campus gehören, fördert die Translation von Forschungsergebnissen in neue Produkte, Anwendungen, klinische Studien und Diagnostika oder Therapeutika (Theranostics) gezielt mit Forschungsgeldern im dreistelligen Millionenbereich.

Frühe Kontakte und ein persönliches Netzwerk aufbauen

Das Knüpfen von Kontakten in Forschung und Industrie begann bei mir bereits recht früh. Als Schüler nahm ich viele Male an „Jugend forscht“-Wettbewerben teil. Um meine Experimente finanzieren und durchführen zu können, suchte ich Kontakt zu Laborgeräteherstellern, Pharma-firmen und Instituten. Viele dieser Kontakte sind bis heute „aktiv“ und haben mich durch meine Ausbildung und über alle Kontinente begleitet. Der persönliche Kontakt, das Interesse an For-schungs- und Entwicklungsarbeiten im eigenen Gebiet sind entscheidend – sowie eine gewisse Zähigkeit. Denn viele Kontakte erweisenen sich oft erst Jahre später als hilfreich und gut. Ebenso lässt sich aus vielen Experimenten, die in eine Sackgasse zu laufen scheinen, extrem viel lernen für die weiteren Experimente und Methoden, denn Anwendungen aus der eige-nen Forschung sind nicht immer auf den ersten Blick zu erkennen. Es hilft daher sehr, früh den Kontakt zur Industrie zu suchen und das Denken in der Industrie und angewandten Forschung zu verstehen. Zudem sind Auslandsaufenthalte ein Muss, denn Forschung ist international und Anwendungen entstehen in den unterschied-lichsten Märkten. Meines Erachtens nach kann die vielbeschworene Erweiterung des Horizonts durch den Blick über den Tellerrand gar nicht genug betont werden. Nur das Verständnis auch anderer Disziplinen, Länder und Kulturen ermöglicht international hochrangige Forschung und internationales Forschungsmanagement, besonders mit Blick auf die zunehmend globale Ausrichtung von Instituten und Firmen. Ganz

Nicht planen – aber mit Zielen und SystemDr. Michael Rossbach, Genome Institute of Singapore, [email protected]

wichtig sind kritisches Denken und Hinterfragen: Mit der Frage nach den wichtigsten Herausfor-derungen für die Zukunft, die die Wissenschaft ja anzugehen versucht, geht immer die Frage nach Fortschritt einher.

Für einen Wissenschaftler geht es darum, Dinge nicht zu akzeptieren, sondern immer weiterzufragen und allen Dingen auf den Grund gehen zu wollen. Das Wecken von Neugierde und Animieren zum Weiterdenken kann gar nicht früh genug gefördert werden. Deshalb finde ich Aktionen wie etwa “Das Haus der kleinen Forscher” in Kindergärten oder Wettbewerbe wie „Jugend forscht“ für unsere Gesellschaft unabdingbar, da sie junge Menschen animieren, eben nicht alle Dinge als Gesetz und als gegeben hinzunehmen.

Dazu passt recht gut der Begriff des „Quer-denkers“für Menschen, die – einfach gesagt

– etwas anderes glauben, meinen oder sagen als die im Corporate Design erzogenen Mit-arbeiter einer Organisation oder Mitglieder einer Gesellschaft. Jeder Einzelne, der in der Wissenschaft arbeitet, muss ein wenig dieser

„Querdenker“-Eigenschaft mitbringen, denn wer nicht durchsetzen will, was er herausgefunden hat, wer das, was er weiß, nicht wert befindet, dafür – gepflegt – zu streiten, hat seine Haus-aufgaben nicht gemacht. Sapere aude, sagte einst Horaz, und Immanuel Kant hat das richtig übersetzt: „Habe den Mut, dich deines eigenen Verstandes zu bedienen.“ Das genügt völlig.

Die Zukunft birgt große Chancen, aber auch Fallstricke …

… der Trick ist, den Fallstricken zu entgehen, die Chancen zu nutzen und bis sechs Uhr wieder zu Hause zu sein …

Ich habe meine Wege in der Ausbildung nie statisch geplant. Es gab keinen Fünf-Jahresplan, sondern ich habe mich von meinen Interes-sen und dem, was mir interessant erschien und Freude bereitet hat, treiben lassen. So bin ich über Sydney wieder in Deutschland, anschließend in den USA, in Singapur, wieder in Deutschland und nun wieder in Singapur gelandet. Gute Kontakte allein reichen natür-lich nicht aus. Man braucht auch Menschen, die einen auf dem Weg begleiten und – ganz wichtig – den Mut, Neues und neue Diszipli-nen erkunden zu wollen. Natürlich muss man bisweilen auch Durststrecken überstehen und sich durch den Dschungel der Administration

kämpfen, doch auch das noch so unflexibel erscheinendste System lässt Spielräume zu. Am Genome Institute – einem der weltweit füh-renden Genomforschungszentren – bin ich nun für den Schritt von der reinen Entdeckung und Validierung biomedizinischer Konzepte in trans-lationale Technologien verantwortlich. Dazu gehören beispielsweise Plattformtechnologien zur Identifizierung neuer Biomarker für die Di-agnostik von Tumor- oder neurodegenerativen Erkrankungen. Das GIS arbeitet ferner an der Entwicklung neuartiger Zell- und Tiermodelle zur Erforschung von Krankheiten, neuen bio-medizinischen Konzepten für die personalisierte Medizin und an stammzellbasierten Krankheits-modellen und deren phänotypischer Charakte-risierung. Das GIS sucht ständig neue Partner, um das breite Spektrum an Technologien und Methoden schnellstmöglich in Anwendungen und klinische Studien zu bringen.

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Service Stellenmarkt

Akademischer Stellenmarkt Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt (auch online), der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu Ihre Anzeige (Ausschreibungstext als Word-Datei, Logo – jpg oder tiff, 300 dpi Auflösung) an [email protected]. Annahmeschluss für die nächste LABorWeLt-Ausgabe „DNA-technologien“ (erscheinungstermin 07.04.2011) ist der 23. März 2011.

Alle Stellenanzeigen finden Sie auch unter:

www.laborwelt.de

PhD Scholarships in Molecular Medicine and

Neuroscience The Medical University of Graz invites excellent students to apply for the PhD programs in Molecular Medicine and/or Neurosciences starting in fall 2011. Up to 21 scholarships will be offered to the best applicants.

The programs provide cutting-edge education in basic principles of human diseases and therapeutics. The thesis projects will focus on various aspects of metabolic and vascular diseases, inflammation, cancer, stem cells, aging of the brain, and neurodegeneration. Research will also integrate basic, applied and clinical sciences, as well as a wide spectrum of experimental techniques, preparing students for doing research in an international environment.

Application requirements:Interested students are welcome to apply for the academic year 2011/2012. To participate in the selection process a candidate‘s application must be submitted by email using the provided forms on the website. The application deadline is March 6, 2011 (24:00 hours, CET).

Interested students please visist www.medunigraz.at/phd for more details!

Applicants must hold an undergraduate degree equivalent to a Master in any discipline of Natural Sciences, Life Sciences or Medicine. Students who will finish their Master studies after the deadline but before July 2011 are welcome to apply as well.

The selection procedure, all training activities and communication will be in English. Thus, excellent written and spoken English skills are required.For selected PhD students there is the possibility for up to 3 years employ-ment with a contract that includes social benefits. Moreover, students receive competitive financial support.

We are looking forward to your application!

Only complete applications will be accepted. The application deadline is March 6, 2011 (24:00 hours, CET).

The Friedrich Loeffler Institute of Medical Microbiology at the University Greifswald is looking for a

PhD candidate (Dr. rer. nat.)

We are seeking a highly motivated and skilled candidate with an interest in host-pathogen interactions. The aim of the research is to unravel the bacterial intracellular survival strategies using Burkholderia pseudomallei as a model organism. The main focuses are the intracellular expression of virulence factors and the relation of anaerobic metabolism and virulence. The results of our work should lead to a better understanding of host pathogen interaction and furthermore to better approaches in therapy and vaccination.

The appointee will pioneer work on the anoxic stages of B. pseudomallei and will learn and use different molecular, microbiological, cell biological as well as immunological approaches. The state-of-the-art proteome and genome facilities present at the University of Greifswald, will guarantee excellent study conditions.

The University and Hanseatic City of Greifswald is located near the bay of Greifswald, which is part of the Baltic Sea between the islands of Rügen and Usedom and offers great recreational possibilities.

Please direct applications (cover letter, CV, publication list) until the 18th Feb. 2011 to

Prof. Dr. Ivo Steinmetz Friedrich Loeffler Institute of Medical Microbiology University Medicine GreifswaldMartin-Luther-Str. 617475 Greifswald, [email protected]

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Doctorate position in Stem Cell Biology for 2 years

with the possibility of extension

Our group is a part of the Institute of Neurophysiology (Director: Prof. Dr. Jürgen Hescheler) located at the University of Cologne (Germany). The Institute is part of the Medical Faculty and is traditionally involved in stem cell research.

Our group is engaged in the exploration of systems involve in mouse, rhesus and human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cell differentiation towards neural and myocardial lineages. More limited is the knowledge on the mechanisms for overall modulation and integration of signals which drive the specific activation of transcriptional systems at a certain differentiation stage.

We are seeking a highly motivated, independent thinking, team- and hard-working candidate with a solid understanding and practical experience in cellular biology and physiology.

The successful candidate will be responsible for determining the role of some specific selected factors in the differentiation and staging of ES and iPS cells of rodent and human origin, leading to a better understanding of the molecular networks and signals governing differentiation. Experi-mental approaches will include both classical cell and molecular biology techniques and advanced technology such as electrophysiology, calcium imaging and microarray.

The applicants must hold a Diploma/Master degree or equivalent in biology and must be fluent in English. The knowledge in the field of embryonic stem cells, molecular biology and electrophysiology is desirable.

The University of Cologne is an Affirmative Action/Equal Opportunity Em-ployer. Women, minorities, and individuals with disabilities are encouraged to apply.

The position is available immediately and will remain open until suitable candidates are found. The salary is according to TV-L.

Applications with Curriculum vitae including contact detail of references and a motivation letter should be sent per email to [email protected]

Filomain Nguemo, Ph.D. · Institute of NeurophysiologyRobert-Koch-Str. 39 · 50931 Cologne, GermanyTel. 0221-478-6940 · Fax 0221-478-3834

www.uni-koeln.de

Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmen-tal Health“ (Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die Forscherinnen und Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensationsfähigkeit des Organismus.

Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren e. V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands.

Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderprei-ses sowie des Total E-Quality-Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt.

Die Abteilung Zebrafisch-Neurogenetik sucht zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine/n

Technische/n Mitarbeiter/in BTA / CTA / MTA / VMTA (163/2010)

Ihre Aufgaben

– Erhaltung von Zebrafisch-Linien

– Genotypisierung durch PCR

– Immunhistochemie und In-Situ-Hybridisierung

– Klonierungsarbeiten

– Laborarganisation und Bestellungen

Ihre Qualifikationen

– Berufsausbildung als BTA, CTA, MTA, VMTA

– Kenntnisse in molekularbiologischen Techniken

– hohe Teamfähigkeit und Einsatzbereitschaft

Unser Angebot

– Tätigkeit in einem innovativen, zukunftsorientierten Unternehmen

– umfangreiches Fortbildungsangebot

– zunächst für zwei Jahre befristetes Arbeitsverhältnis und eine Vergütung nach TVöD

Bitte senden Sie Ihre Bewerbung bevorzugt per E-Mail an:Dr. Prisca ChapoutonE-Mail: [email protected]: +49-(0)89 3187-3686

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH)Abteilung Zebrafisch-NeurogenetikIngolstädter Landstr. 185764 Neuherberg




The International Giessen Graduate School for the Life Sciences (GGL) of the five Faculties above invites applicants for the

Doctoral Programs in the Life Sciences

The Doctoral Programs consist of a three-year interdisciplinary graduate course curriculum combined with an experimental pro-ject leading to a dissertation. Each doctoral researcher will be supervised by two professors from different faculties and will be-nefit from our Doctoral Researcher Development Programme. Seminars and courses are conducted in English; German language courses are offered for international students. Depending on the project selected and own qualifications students may receive a stipend and may be eligible to register for one of the doctoral degrees offered at the Justus-Liebig-University Giessen (Dr. med., Dr. med. dent., Dr. biol. hom., Dr. med. vet., Dr. biol. anim., Dr. rer. nat., Dr. agr. and Dr. oec. troph).

Applicants may choose between eight interdisciplinary research sections: Nutrition and Metabolism; Infection and Immunity; Heart, Lung and Blood Vessels; Protein and Nucleic Acid Interactions; Neurosciences; Reproduction in Man and Animals; Stress Re-sistance and Adaptation; Molecular Interactions at Natural Interfaces. A Master’s degree or equivalent is required for admission.Names of prospective supervisors and research projects as well as other information necessary for application can be found at:

http://www.uni-giessen.de/ggl/overview/application

Please submit your application using our online application system before February 28, 2011. Please direct any enquiries to [email protected]

Das Institut für Molekulare Infektionsforschung der Julius-Maximilians-Universität sucht eine/n

Technischen/n Assistentin/en oder Biologielaborantin/en

Die Forschungsgruppe von Prof. Dr. Jörg Vogel befasst sich schwerpunktmäßig mit der Charakterisierung von molekularen Mechanismen regulatorischer RNA in Bakterien und Eukaryonten (siehe auch http://www.infektionsforschung.uni-wuerzburg.de).

Bewerber/innen sollten mit Methoden der allgemeinen Molekularbiologie, Mikrobiologie und/oder Zellbiologie vertraut sein. Die Aufgaben sollen nach Einarbeitung weitgehend selbständig durchgeführt werden. Die Stelle kann ab dem 1. April 2011 oder nach Absprache besetzt werden und ist zunächst auf 3 Jahre befristet. Die Stelle ist auch in Teilzeit besetzbar.

Die Vergütung erfolgt nach TV-L. Schwerbehinderte Bewerberinnen und Bewerber werden bei ansonsten im Wesentlichen gleicher Eignung bevorzugt eingestellt.

Bewerbungen bitte mit Betreff „TA-Stelle AG Vogel“ schriftlich oder per E-Mail bis 15. März 2011 an:

[email protected] / Institut für Molekulare Infektions-biologie, Josef-Schneider-Str. 2, Bau D15, 97080 Würzburg

Die Abteilung Molekulare Phytopathologie des Max-Planck-Instituts für Pflan-zenzüchtungsforschung sucht zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine/n

Biologisch-Technische/n Angestellte/n in Teilzeit

für die Pflege und Katalogisierung der biologischen Stamm-Sammlung. Zum Aufgabengebiet gehören die Vermehrung von phytopathogenen Pilzen und anderen Mikroorganismen sowie die Kultivierung und Katalogisierung von Pflanzenkollektionen. Eine abgeschlossene Ausbildung als Biologisch Technische/r Angestellte/r ist Voraussetzung. Erfahrungen in der Mikrobiologie sind wünschenswert. Die vorgesehene Arbeitszeit beträgt 19,5 Stunden pro Woche. Die Stelle ist zunächst auf 2 Jahre befristet. Die Bezahlung erfolgt entsprechend Ihrer Qualifikation nach TVöD. Die Sozialleistungen entsprechen denen des öffentlichen Dienstes.

Die Max-Planck-Gesellschaft ist bemüht, mehr schwerbehinderte Menschen zu beschäftigen. Bewerbungen Schwerbehinderter sind ausdrücklich er-wünscht.

Wir freuen uns über Ihre Bewerbung bis zum 28. Februar 2011 vorzugsweise an [email protected] oder per Post an:

Ute von Ciriacy Max-Planck-Institut für Pflanzenzüchtungsforschung Carl-von-Linné-Weg 10, 50829 Köln

Max-Planck-Institut für PflanzenzüchtungsforschungMax Planck Institute for Plant Breeding Research




Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmen-tal Health“ (Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die Forscherinnen und Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensationsfähigkeit des Organismus.

Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren e. V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands.

Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderprei-ses sowie des Total E-Quality-Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt.

Die Abteilung Proteinanalytik sucht zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine/n

Technische/n Mitarbeiter/in – BTA / MTA / CTA (214/2010)

Ihre Aufgaben

– Genomisch-proteomische Untersuchungen

– Aufreinigung von Proteinen und Proteinkomplexen aus Zellkultur

– Funktionelle Untersuchungen von Proteinen

– Zellfraktionierung, Probenaufbereitung für Massenspektrometrische Analysen

– Abfassen der Erfolgskontrollberichte

– Organisation und Durchführung des Workflows

– selbständige Koordinierung von Versuchen

Ihre Qualifikationen

– abgeschlossene Berufsausbildung als BTA / MTA / CTA

– gutes Englisch

– versierter Umgang mit MS-Office

– ausgeprägte Kommunikations- und Teamfähigkeit

Unser Angebot

– Tätigkeit in einem innovativen, zukunftsorientierten Unternehmen

– umfangreiches Fortbildungsangebot

– zunächst für zwei Jahre befristetes Arbeitsverhältnis und eine Vergütung nach TvöD

Bitte senden Sie Ihre Bewerbung bevorzugt per E-Mail an:Saskia HanfE-Mail: [email protected]: +49-(0)89 3187-3566

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH)Abteilung ProteinanalytikIngolstädter Landstr. 185764 Neuherberg

Translationale Onkologie an der Universitätsmedizin der JGU Mainz

Job vacancy for a

molecular biologist technical assistant

to work in TRON´s next-generation sequencing lab.

TRON, the Institute for Translational Oncology and Immunology, is a new, rapidly growing biopharmaceutical institute seeking to diagnosis and treat unmet medical needs through novel therapies. TRON is located in Mainz, Germany, has strong connections to the University of Mainz and local start-up companies, and is developing novel platforms for therapies and biomarkers. As part of our team, you‘ll have the opportunity to collaborate with talented and dedicated colleagues, develop and expand your career, be on the cutting-edge of science, and help treat disease.

TRON is building a multidisciplinary molecular biology and computational genomics unit with experience in computational genomics, biotechnology, next-generation sequencing (NGS), and molecular biology. We are searching for a molecular biologist technical assistant to strengthen our next-generation sequencing team.

Duties and Responsibilities: – Extract RNA and DNA from tissue samples and library construction – Run an Illumina HiSeq next-generation sequencer (NGS) – Work with molecular and computational biologists – Participate in the invention and development of new lab methods and

biotechnology platforms

Experience & Qualifications: – Experience with nucleic acid molecular biology, including PCR and

RT-PCR – Experience generating genomic datasets, such as with next-generati-

on sequencing or microarrays – Attention to detail and practical problem-solving skills – Strong teamwork and communication skills – Willingness to work in an exciting and dynamic environment

Preferred: – Experience working in a next-generation sequencing or microarray

facility – Experience constructing libraries – Experience working with clinical RNA or DNA samples – Experience working with a LIMS system – Familiarity with disease-relevant biology, particularly oncology – Experience generating genomic data for biomarker and drug target

discovery

We look forward to your application.

Contact Kerstin Lehrbach ([email protected]) Please write ‘NGS TA’ in the email ‘Subject’ line.



Seite bitte abtrennen – per Fax an 030-264921-11 Service Verbände

Dt. Ver. Gesell. f. Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL)

Geschäftsstelle der DGKLIm Mühlenbach 52 b53127 BonnTel.: +49-(0)-228-92-68-9522Fax: +49-(0)[email protected]

Deutsche Gesellschaft für Proteomforschung

c/o MPI für BiochemieAm Klopferspitz 18a82152 MartinsriedTel.: +49-(0)-89-1897-9007Fax: +49-(0)[email protected]

BIO Deutschland

Tegeler Weg 33/berlinbiotechpark10589 BerlinTel.: +49-(0)-30-3450593-30 Fax: +49-(0)-30-3450593-59 [email protected]

Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM)

c/o Institut für Hygiene und Med. MikrobiologieCarl-Neuberg-Straße 130625 HannoverTel.: +49-(0)-511-532-4655Fax: +49-(0)-511-532-4355www.dghm.org

bts (Biotechnologische Studenteninitiative e.V.)

c/o BIOCOMStralsunder Straße 58–5913355 BerlinTel.: +49-(0)-2649-21-21Fax: +49-(0)-2649-21-11www.btsev.de

Gesellschaft für Genetik

c/o HZM – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit/Inst. of Develop-mental GeneticsTel.: +49-(0)-89-3187-2610Fax: +49-(0)-89-4620www.gfgenetik.de

Gesellschaft für Signaltransduktion

c/o Prof. Dr. Ralf HassMed. Hochschule HannoverAG Biochemie u. Tumorbiol.30625 HannoverTel.: +49-(0)-511-532-6070Fax: +49-(0)-511-532-6071www.sigtrans.de

Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie

Geschäftsstelle der DGPTAchenbachstraße 4340237 DüsseldorfTel.: +49-(0)-211-600-692-77Fax: +49-(0)[email protected]online.de

Nationales Genomforschungsnetz

c/o DKFZIm Neuenheimer Feld 58069120 HeidelbergTel.: +49-(0)-6221-424-743Fax: +49-(0)[email protected]

Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik

Institut für Humangenetik Calwer Straße 772076 TübingenTel.: +49-(0)-7071-2977692Fax: +49-(0)-7071-295171peter.bauer@ med.uni-tuebingen.dewww.hihtuebingen.de/dgng/

Netzwerk Nutrigenomik

Netzwerk NutrigenomikArthur-Scheunert-Allee 11414558 NuthetalTel.: +49-(0)-33200-88-301Fax: +49-(0)[email protected]

DiagnostikNetBB

Netzwerk DiagnostikBerlin-Brandenburg e.V.Neundorfstraße 1716761 HenningsdorfTel.: +49-(0)-3302-55-199-14Fax: +49-(0)[email protected]bb.de

Verband der DiagnosticaIndustrie e.V.

Verband der Diagnostica-Industrie e.V.Neustädtische Kirchstr. 810117 BerlinTel.: +49-(0)-30-200-599-40 Fax: +49-(0)[email protected]

Österreichische Reinraumgesellschaft (ÖRRG)

ÖRRGNeudorf 41A-8262 Ilz Tel.: +43-(0)-3385-8117 Fax: +43-(0)[email protected] www.oerrg.at

Österreichische Ges. f. Laboratoriums medizin & Klinische Chemie

ÖGLMKC GeschäftsstelleInfomedica-KEG, Xenius BehalTullnertalgasse 72A-1230 WienTel./Fax: +43-(0)-1889-6238 [email protected]

www.oeglmkc.at

Kontakt zu Verbänden Die Mitglieder der nachfolgenden Fachgesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für eine Mitarbeit oder einen Beitritt interessiert, erreicht die Fachgesellschaften unter den folgenden Kontakt daten:

Ichinteressieremichfür denBeitritt UnterstützungfürJungwissenschaftler Interessenvertretung eineSpende FachgruppenimBereich

Verband(sieheunten,bitteankreuzen)

BittekontaktierenSiemich

Name Firma

Tel. Fax

E-Mail

GESEL

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HAFT FÜRG

EN

ETIK

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Service Produktwelt


Thermo Fisher Scientific Inc. hat seine neuen Thermo Scientific KingFisher-Nukleinsäureauf-reinigungs-Kits vorgestellt, die einen höheren Durchsatz und schnellere Ergebnisse ermögli-

Thermo Fisher

Reagenzien und Kits für die Nukleinsäure-Reinigungkann unbeaufsichtigt durchgeführt werden. Zusätzlich werden höhere Probenreinheit und -erträge erreicht. Die KingFisher®-Kits sind für verschiedene Probentypen – von Blut bis zu Pflanzenmaterial – erhältlich und bieten eine kostengünstige Workflow-Lösung, die sich für biotechnologische, klinische, akademische und pharmazeutische Laboratorien eignet.

Der KingFisher®-Partikelprozessor sorgt für eine schnelle und gründliche Aufreinigung von DNA oder RNA und erhöht die Effektivität nachgeschalteter Analysen.Die neue Palette der Thermo Scientific KingFisher-Nukleinsäure-aufreinigungs-Kits ermöglicht es, mit einer ein-zigen Quelle einen kompletten Arbeits ablauf zu erstellen – von der Probenvorbereitung bis hin zur nachgeschalteten Applikations-analyse. Weitere Informationen stehen unter www.thermoscientific.com/kingfisher zur Verfügung.

Thermo Fisher Scientific Inc.Natalie DaleckyTel.: +1 -(0)508-742-5254natalie.dalecky@thermofisher.comwww.thermoscientific.com/kingfisher

Die Nikon GmbH stellt die neueste Generation ihres kompakten Mikroskopsystems für das „Confocal Imaging“ vor. Aufbauend auf Nikons optischer Spitzentechnologie gewährleistet das neue, modulare konfokale Laser-Scanning-Mikroskop C2 brillante Bildqualität und die Aufzeichnung schneller Bildfolgen. Die Steu-erung des C2 erfolgt über die Version 3.2 von Nikons Imaging-Software NIS-Elements C. Damit steht eine einheitliche, einfach bedien-bare und umfangreiche Software-Plattform zur Verfügung. Diese bietet umfangreiche Imaging-Optionen – sowohl für die konfokale als auch Weitfeldmikroskopie. Das C2 bietet exzellente Hard- und Softwarestabilität, ge-paart mit Spitzenoptik und verfügt über drei Detektoren (PMT) für das Mehrkanal-Imaging. Das flexible, modulare Design erlaubt eine problemlose Erweiterung des Systems um einen 32- PMT-Spektraldetektor, mit dem über-lappende Fluoreszenzen über eine Bandbreite von bis zu 320 nm aufgenommen und spektral entmischt werden können. Mit dem C2 können maximal 23 frames/s (512 x 32) beziehungsweise 3 frames/s (512 x 512, bidirektional) erzielt wer-den. Elements C unterstützt die gesamte Palette der Nikon-Konfokal-Mikroskope und ermöglicht die Erstellung individueller Protokolle für die Kontrolle der Mikroskop-Komponenten ebenso zuverlässig, wie Multi-Kamera-Anordnungen,

so dass der Ablauf und die Überwachung aller experimentellen Parameter sehr erleichtert wird. Darüber hinaus ist die Software-Reihe NIS-Elements die konsistente und universelle Soft-wareumgebung für Core Imaging Facilities oder Multi-User-Umgebungen und unterstützt eine Vielzahl von Techniken und Anwendungen. Dies erlaubt Wissenschaftlern, ohne Umgewöhnun-gen und zusätzlichen Einarbeitungsaufwand, zwischen konfokaler, Weitfeldmikroskopie und anderen Imaging-Techniken zu wechseln.

Nikon GmbH Dr. Jörg Kukulies Tiefenbroicher Weg 25 40472 Düsseldorf Tel.: +49-(0)211-9414-217Fax: +49-(0)211-9414-322 [email protected] www.nikon.de

chen. Die Kits enthalten alle benötigten Puffer und Reagenzien und wurden zur Verwendung mit Thermo Scientific KingFisher Magnetparti-kelprozessoren optimiert. In dieser Konfigura-tion ist der gesamte Ablauf automatisiert und

Im PromoKine Zellbiologie-Katalog 2011/2012 finden sich zahlreiche neue, interessante Pro-dukte für die zell- und molekularbiologische Forschung. Er enthält eine große Auswahl erst-klassiger und anwenderfreundlicher Reagenzien und Kits aus unterschiedlichsten Anwendungs-bereichen – von Kits für die Anfärbung von Zellstrukturen und die Analyse von zellulären Prozessen (zum Beispiel Apoptose, Proliferation, Viabilität, Zytotoxizität) bis zur hocheffizienten Transfektion von primären Zellen und Zelllinien mit DNA, siRNA und Proteinen. Andere Produkte können für die Klonierung, Expression und Suppression sowie Quantifizierung von Genen eingesetzt werden. PromoKine bietet außerdem Materialien für die Fluoreszenz-Markierung

Promocell

Erstklassige Reagenzien und hervorragende Kits

von Proteinen, Antikörpern sowie DNA oder RNA an. Einen weiteren Schwerpunkt bilden Reagenzien und Hilfsmittel für die Isolierung von Nukleinsäuren und Proteinen sowie für den Nachweis, die Eliminierung und Präven-tion von Mykoplasmen-Kontaminationen in der Zellkultur. Außerdem bietet der neue PromoKine-Katalog ein breites Sortiment an hochqualitativen und preisgünstigen primären und sekundären Antikörpern, Zell- und Gewe-belysaten, ELISA-Kits sowie rekombinanten Proteinen. Der Katalog ist kostenlos bei der PromoCell GmbH erhältlich. Er kann auch unter www.promokine.info/catalog heruntergeladen werden.

PromoCell GmbHJürgen BeckerTel.: +49-(0)-6221-64 93 [email protected]

Nikon

Universelle Imaging Plattform

46-48_LW1_11_Pis_bk.indd 46 10.02.2011 12:18:13 Uhr

Service Produktwelt


duktion in Länge und Gewicht aus. Die acht neuen Modelle entsprechen damit selbst Erwartungen anspruchsvollster Anwender. Eine verbesserte Instrumentenführung ist durch das optimale Größen/Längen-Verhältnis gewährleistet, das die perfekte Handkontrolle bei der Dosierung in schmale Mikroröhrchen garantiert. Das innovative Dichtringkonzept eliminiert jeglichen Reibungsaufwand und ermöglicht somit eine sanfte Betätigung des Kolbens, ohne Handermüdung. Die Acura® manual XS sind, ohne neuerliche Justierung, komplett autoklavierbar. Das sogenannte Swift-set-System, mit integriertem Schlüssel, ermöglicht jedoch jederzeit eine einfache Ka-librierungsprozedur durch den Anwender. Der Kalibrierungsschieber ist mittels eines selbst-klebenden Siegeletiketts gut geschützt. Jedes Instrument wird mit einer Seriennummer gekennzeichnet und mit einem individuellen Kontrollzertifikat geliefert. Weitere Informati-onen zur Produkt-Palette von Socorex gibt es im Internet unter www.socorex.com.

Socorex Isba S.A.Champ-Colomb 71024 Ecublens, Schweiz Tel.: +41-(0)21-651-6000Fax: +41-(0)[email protected]

Socorex hat eine neue Mikroliterpipette auf den Markt gebracht. Die Acura® manual XS-Linie wurde gezielt für die wissenschaftliche Forschung entwickelt und zeichnet sich durch sanft zu betätigende Druckknöpfe sowie Re-

Porvair

Online-Videopräsentationen erwecken Mikroplattenprodukte zum Leben

Neue Komplettlösung für Klinik und For-schung: Mit labSens präsentiert Olympus eine leistungsstarke Dokumentations-Software, deren Benutzeroberfläche den mikroskopischen Arbeitsabläufen folgt. Alle wesentlichen Funktionen zur Bildaufnahme, -analyse und -dokumentation sind dank der nahtlosen Integration der neuen BX3-Mikro-skope von Digitalkameras und Automations-komponenten deutlich zu erkennen sowie leicht zu bedienen. Die Software ist damit das optimale Bindeglied zwischen Anwender, Applikation und Mikroskopsystem.

labSens unterstützt die neuen klini-schen Mikroskope BX3 sowie die Imaging-Digitalkameras von Olympus und erfüllt alle wichtigen Imaging-Anforderungen des modernen klinischen Labors. Von der Bild-aufzeichnung über die Verarbeitung bis hin zur Besprechung der gewonnenen Daten: Die Software überzeugt mit einer leicht zu handhabenden grafischen Benutzeroberflä-che, auf der die am häufigsten genutzten

Olympus

Effizienter Workflow und optimale Dokumentation

Funktionen definiert werden können. Die Anwender sind so in der Lage, sich ihre indi-viduelle Imaging-Lösung aufzubauen, ihren Workflow zu verbessern und sich eine ideale interaktive Arbeitsumgebung zu schaffen, in der sie Bilder aufnehmen, darstellen, besprechen, vermessen und verwalten. Für noch mehr Effizienz und Ergonomie lassen sich auch weitere automatisierte und moto-risierte Komponenten des BX3- Systems – wie zum Beispiel die kodierten manuellen oder komplett motorisierten Objektivrevolver, Kondensoren und der Tisch – vollständig kontrollieren.

Olympus Deutschland GmbHAndrea Rackow Marketing Communication Tel: +49-(0)40-23773-4612 Fax: +49-(0)40-2308 17 [email protected] www.olympus.de

verfügt über umfangreiche Expertise auf dem Gebiet der Mikrotiterplattentechnologie und -fertigung, das in den Bereichen Life Sciences, Arzneimittelforschung, kombinatorische Che-mie, Festphasenextraktion, Proteinreinigung, Hochdurchsatz-Screening, Proteomik und Genomik zur Anwendung kommt.

Porvair Sciences Ltd.Dr. Bill Bradbury Tel.: +44-(0)[email protected]/videos.php

Porvair Sciences Ltd. hat neuer Videos mit Pro-duktpräsentationen auf seiner Unternehmens-Website www.porvair-sciences.com/videos.php veröffentlicht. Die neue Videoplattform soll Interessenten, die mit Mikrotiterplatten oder -technologien arbeiten, nützliche Informatio-nen in einem neuen Format bieten. Livestream-Videos lassen Produkte und Dienste auf ganz andere Art und Weise lebendig werden als etwa mit Text- und Bildmaterial möglich. Mit dem Live-Format der Videos hofft Porvair nicht nur potentielle Kunden anzusprechen, sonden zugleich die zuverlässige Funktions-weise, Leistungsfähigkeit und hohen Qualität der hauseigenen Produkte zu dokumentieren. Unter den ersten auf die Website gestellten Videos von Porvair Sciences befinden sich Produktpräsentationen der populären Mic-roplate Sealer MiniSeal Plus und TriSeal, der Microplate Evaporator MiniVap und UltraVap, des Universal Robotic Manifold sowie der BioVyon C8- und C18-Silica-Säulen. Das 1992 ge-gründete Unternehmen Porvair Sciences Ltd.

Socorex

Neue Mikropipetten Acura manual XS

46-48_LW1_11_Pis_bk.indd 47 10.02.2011 12:18:28 Uhr

Service Produktwelt


Hamamatsu

Hamamatsu stellt das neue MTP-Lesegerät FDSS/μCELL vor

Zeiss

Hochauflösende LokalisationsmikroskopieDas US-amerikanische Patentamt hat Dr. Eric Betzig und Dr. Harald Hess ein weiteres Patent für deren Erfindung zur superauflösenden Loka-lisationsmikroskopie erteilt. Carl Zeiss hatte im Jahr 2007 die Exklusivrechte für die Vermarktung dieser Technologie erhalten. Gemeinsam mit den bisher erteilten Patenten werden nunmehr umfangreiche Systeme und Verfahren der Su-perauflösungsmikroskopie geschützt, die durch Vereinzeln und Lokalisieren von Molekülen eine Abbildung jenseits der Abbeschen Auflösungs-grenze realisieren. Das nun erteilte Patent erweitert den Schutzumfang auf Systeme und Verfahren, bei denen das Vereinzeln durch photo optisches Transformieren der Moleküle zwischen verschiedenen Energiezuständen erfolgt. Diese Technologie erweitert die Art und Weise, wie „klassische“ Farbstoffe in An-wendung der Superauflösungsmikroskopie eingesetzt und genutzt werden können. Die neuerliche Erteilung ist eine weitere Bestäti-

Anknüpfend an die etablierte FDSS7000 HTS-Screening Plattform stellt Hamamatsu Photonics nun das FDSS/μCell für kinetische Fluoreszenzassays – Calcium (Fluo- 3/4) und Membrane Potential (FMP) Farbstoffe – vor. Als Kamera-basiertes Plattenlesesystem wurde das FDSS/μCell dabei auf die Anforderungen des Compound Screenings und der Assay-Entwicklung in der pharmazeutischen Industrie, in CROs und der Biotechnologie abgestimmt. Durch die verwendete Hamamatsu FDSS- und CCD-Kamera-Technologie erreicht das FDSS/μCell höchste Sensitivität. Kürzeste Assayzeiten werden durch simultanes Dispensieren und gleichzeitiges Auslesen aller Wells im 96- oder 384-Plattenformat erreicht. Agonist/Antago-nist-Assays lassen sich durch die Möglichkeit von zwei Zugaben realisieren. Hierbei wird durch Waschen der Tips zwischen den Zugaben eine Verschleppung erfolgreich vermieden. Die Pipettenspitzen können zudem mehrere Male verwendet werden. Das System ist auf eine einfache und schnelle Handhabung optimiert.

Hamamatsu Photonics Deutschland GmbHEva-Maria TomicArzbergerstraße 1082211 HerrschingTel.: +49-(0)8152-375-139Fax: +49-(0)8152-375-111,[email protected] www.fdssdrug.com

gung der erfinderischen Leistung von Betzig und Hess und stärkt die Position der Carl Zeiss MicroImaging GmbH auf dem Gebiet der Mik-roskopie mit Superauflösung.

Carl Zeiss MicroImaging GmbHDr. Jochen ThamTel.: +49-(0)3641-64-3949 [email protected]/elyra

Metrohm

Ranzige Öle erkennenDie Oxidationsstabilität bezeichnet die Wider-standsfähigkeit von Fetten, Ölen und fetthal-tigen Lebensmitteln gegenüber Oxidations-prozessen und ermöglicht Aussagen darüber, wie schnell Fette oder Öle ranzig werden. Der 743 Rancimat ist das am häufigsten gebrauchte Gerät zur Messung der Oxidationsstabilität und ermöglicht die simultane Analyse von bis zu acht Proben. Weitere Details zur Ranicmat-Methode liefert ein technisches Poster von Metrohm.

Bei der Ranicmat-Methode wird ein Luftstrom durch die fetthaltige Lebensmittelprobe ge-leitet, die bei einer definierten Temperatur in einem beheizbaren Aluminiumblock vorge-halten wird. Die aus der Öl- oder Fettprobe austretende Luft wird in Form von Bläschen durch ein Gefäß mit deionisiertem Wasser geleitet. Die Leitfähigkeit des Wassers wird kontinuierlich gemessen und die gewonnenen Daten werden von der Rancimat-Software im angeschlossenen Rechner gesammelt. Das Ende der Induktionszeit wird durch das Auftreten von sekundären Oxidationspro-dukten angezeigt – flüchtige organische Säuren, hauptsächlich Ameisensäure –, die aus der Probe entweichen und im Wasser absorbiert werden. Ab diesem Zeitpunkt steigt die Leitfähigkeit markant an. Eine ganze Reihe von fetthaltigen, festen Lebens-mitteln wie Mandeln, Erdnüsse, Erdnussflips, Kartoffelchips, Butterkekse, Pommes frittes und Fertignudeln wurden mit der Rancimat-Methode erfolgreich getestet. Für die meisten Lebensmittelproben empfiehlt sich die Pul-verisierung. Je homogener die Probe, desto besser (steiler) fällt die Messkurve aus. Wenn die Probe nicht pulverisiert werden kann, sollte sie zerkleinert bzw. zerquetscht werden, wobei die einzelnen Partikel eine Größe von ungefähr 5 mm haben sollten.

Deutsche Metrohm GmbH & Co. KGPeter KrebsIn den Birken 370794 FilderstadtTel.: +49-(0)711-77088-0Fax: +49-(0)[email protected]

46-48_LW1_11_Pis_bk.indd 48 10.02.2011 12:18:49 Uhr

Service Kalender


10.3.115. Senftenberger InnovationsforumMultiparameteranalytik, Senftenberg(Web: www.zmdb.de/multiparameter/)

14.-15.3.11 BIO-Europe Spring® 2011 – International Partnering Conference, Milano (IT)Info: Tom Voigt, EBD Group (E-Mail: [email protected], Web: www.ebdgroup.com/bes)

15.-16.3.11 4th International Congress on Bio-based Plastics and Composites, Köln(Web: www.biowerkstoff-kongress.de)

Februar 2011 – April 2011

Veranstaltungskalender22.2.11IBN-Forum: Stehen wir vor einer Biologisie-rung der chemischen Industrie?, HamburgInfo: Gerlinde Loebkens, TuTech Innovation GmbH (E-Mail: [email protected], Web: www.tutech.de)

24.-26.2.114th Conference on Recombinant ProteinProduction, Halle (Saale)Info: Exzellenznetzwerk Biowissenschaften(E-Mail: [email protected], Web: www.exzellenznetzwerk-biowissenschaften.uni-halle.de/)

10.-12.3.115th Glycan Forum, BerlinInfo: Dr. Volker Rosenbaum, Netzwerk Glykobiotech-nologie (E-Mail: [email protected],Web: www.glyconet.de)

11.-12. April 2011, Berlin

4. Entrepreneur-Summit

Zum vierten Mal bietet die Stiftung Chari-té Ärzten und Forschern die Möglichkeit, sich mit Unternehmern auf dem „Charité Entrepreneurship Summit“ auszutauschen. Praxismodule wie „Business Speed Dating“ und das „Charité Partnering“ helfen, Ideen weiterzuentwickeln und Innovationen vor-anzutreiben. Info: www.charite-summit.de

19. April 2011, Heidelberg

Für Einsteiger: Contact 2011

Der Verein BioContact e. V. organisiert zum 11. Mal die im DKFZ stattfindende Life Sciences-Jobmesse Contact. Absolventen aus Naturwissenschaften und Medizin treffen auf Personaler von Biotech- und Pharmaunternehmen. Neben einem breit-gefächerten Vortragsprogramm gibt es einen kostenlosen Bewerbungsmappen-check und Workshops rund um das Thema Berufseinstieg. Info: www.biocontact.info

23.-24. März 2011, Wien

Techniken zur Proteinanalyse

Experten aus Industrie und Zulassungsbe-hörden treffen sich, um Validierungsstrate-gien für die biopharmazeutische Protein-analyse zu besprechen. Vor- und Nachteile neuer Analysestrategien werden auf der „Protein Analytical Technologies“ erörtert. Info: www.gmp-compliance.org/protein

15.-16.12.10BMBF-Fachforum „Pflanzenforschung, Er-nährung und Gesundheit“ , BerlinInfo: Dr. Dirk Büssis , Geschäftsstelle Pflanzenfor-schung (Tel.: 0331-56 78 301, E-Mail: [email protected], Web: www.gabi.de)

17.12.10

15.3.11Advanced in Cell-Based ScreeningTechnologies, Cambridge (UK)Info: Jackie Howard, ELRIG/SLAS(E-Mail: [email protected],Web: www.elrig.org)

16.-23.3.11BIOKATALYSE2021 Summer School 2011 – Protein-based Biomaterials for Industrial Biotechnology, Rolduc (NL)/AachenInfo: Karin Meyer-Pannwitt, BIOKATALYSE2021 Clustermanagement TuTech Innovation GmbH(E-Mail: [email protected],Web: http://biokatalyse2021.de/springschool/)

16.-17.3.11International Industrial Conventionon Biomimetics 2011, BerlinInfo: (Web: www.biomimetics-convention.com)

17.3.11Fachforum „Auf dem Weg zur Personali-sierten Medizin – Herausforderungen und Potentiale für die IT“, KonstanzInfo: Michael Statnik, BioLAGO e.V. - life science network (Tel.: +49-7531-84 5371,E-Mail: [email protected], Web: www.biolago.org)

21.-25.03.11Biotechnology: State of the Art and Pros-pects of Development + Biotech World 2011, Moskau (RU)Info: Vladimir E. Aleshnikov,JSC EXPO-BIOCHIM-TECHNOLOGIES(E-Mail: [email protected],Web: www.mosbiotechworld.ru/eng)

22.-24.3.11WorldBiofuels Market, Rotterdam (NL)Info: Green Thinking (Services) Ltd.(E-Mail: [email protected],Web: www.worldbiofuelsmarkets.com)

23.-24.3.11Forum Life Science 2011, MünchenInfo: Dr. Matthias Konrad, Bayern Innovativ(E-Mail: [email protected],Web: www.bayern-innovativ.de/fls2011)

24.-27.3.11Innate and Adaptive Immune Responseand Role of Tissues in Immune Regulation, Davos (CH)Info: Ute Hechenberger, Swiss Institute of Allergy and Asthma Research (SIAF)(E-Mail: [email protected], Web: www.wirm.ch)

27.-29.3.11BioVision – 7th World Life Sciences Forum, Lyon (F)Info: BioVision – Fondation Scientifique de Lyon,Web: www.biovision.org)

28.-30.03.1123rd DIA-EuroMeeting, Genf (CH)Info: DIA Drug Information Association(Web: www.diaeurope.org/euromeeting2011)

49_LW1_11_Termine.indd 49 11.02.2011 11:20:54 Uhr


Ausblick

Inserentenverzeichnis

Beckman Coulter GmbH . . . . . . . . . . . . . . . 17Beckman Coulter Genomics Inc . . . . . . . . 23BIO .NRW - Innovationspreis . . . . . . . . . . . 5Candor Bioscience GmbH . . . . . . . . . . . . . 15DASGIP AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33Deutsche Messe AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9EBD-Group, BIOEurope Spring . . . . . . . . . U3Fördergesellschaft IZB mbH . . . . . . . . . . . 27Hamamatsu Photonics Dtl . GmbH . . . . . 11Kompetenznetzwerk Stammzell -forschung NRW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37MDT Ontario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . U2Olympus Deutschland GmbH . . . . . . . . . 5New England Biolabs GmbH . . . . . . . . . . . U4Perkin Elmer Inc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13Porvair Sciences Ltd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25S4L - Science for Life . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Sartorius Stedim Biotech . . . . . . . . . . . . . . 21SOCOREX ISBA S .A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Stiftung Charité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

Deutschland revitalisiert Gesundheitsforschung von Thomas Gabrielczyk, Redaktion LABORWELT

Nach Jahrzehnten des Mittelmaßes und des international nicht konkurrenzfähigen Nebeneinan-derherforschens von Medizinern und Biologen, Akademikern und Biotech-Unternehmen kittet die deutsche Bundesregierung in der Gesundheitsforschung jetzt zusammen, was lange nicht zusam-menpassen wollte. Pünktlich zum Wissenschaftsjahr 2011, das sie unter das Motto „Forschung für unsere Gesundheit“ gestellt hat, investiert der Bund in den nächsten vier Jahren 5,5 Mrd. Euro, um gegen Großmächte der klinischen Forschung und Translation wie die USA anzutreten. Das feder-führend von Bundesforschungsministerin Annette Schavan und Gesundheitsminister Philipp Rösler gestaltete Nationale Gesundheitsforschungsprogramm ist dabei aber nicht kurzatmig, sondern auf insgesamt acht Jahre ausgelegt. Allein 475 Mio. Euro in den ersten vier Jahren bis zum Update des Programmes lassen sich die Minister die Zentralisierung der Forschung zu Volkskrankheiten in sechs Deutschen Zentren bzw. Konsortien der Gesundheitsforschung kosten, in denen je gut ein halbes Dutzend der besten Forschungseinrichtungen zusammenarbeiten. Zwei der Deutschen Zentren – für Neurodegenerative Erkrankungen und für Diabetesforschung – sind bereits 2009 gestartet. Weitere vier – für Herz-Kreislauf-Forschung, Krebs, Infektions- und für Lungenkrankheiten – sollen in diesem Sommer offiziell beginnen. Daneben fließt viel Geld in indikationsoffene medizinische Translationszentren, die die Grundlage für die vielgepriesene personalisierte Medizin und deren Umsetzung in die Medizinpraxis sowie präventive Ernährungs- und Impfkonzepte schaffen sollen. Ziel dabei: das dauerklamme Gesundheitssystem zu entlasten. Den Output sollen Zentren der Gesundheitsökonomie anstelle des IQWiG und des G-BA messen.

Um das erklärte Ziel zu erreichen, „das Inno-vationspotential forschungsintensiver Unter-nehmen der medizinischen Biotechnologie zu heben“, sind auch Infrastrukturprojekte ange-laufen, um Biomarker nicht wie bisher – nach Gutdünken und nicht immer zugänglich – in Ge-weben und Körperflüssigkeiten zu identifizieren . Schon hat das BMBF fünf Cluster ausgewählt, die die an der Berliner Charité sowie in Aachen, Heidelberg, Kiel und Würzburg vorhandenen Biomaterialbanken bündeln, standardisieren und bei der Errichtung einer „Nationalen Bio-materialbank“ Pate stehen sollen .

Mit den Gesundheitsforschungszentren schafft die Bundesregierung die Grundlagen für die Rekrutierung ausreichend großer Patientenkollektive, in denen mit Hilfe der High-Throughput-Biologie nach ausführlicher Phänotypisierung prospektiv nach Biomarkern,

LABORWELT (ISSN 1611-0854) erscheint zweimonatlich im Verlag der

BIOCOM Media GmbHStralsunder Straße 58–5913355 Berlin, GermanyTel./Fax: 030/264921-0 / 030/[email protected]

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Impressum

www.laborwelt.de

ThemaDNA-TechnologienOmics-Technologien und die Auswertung der gewonnenen Daten sind die Förderthemen der nächsten vier Jahre . Auf welche Tools aktuell in den Labors gesetzt wird und wie die Laborhersteller versuchen, die Nachfrage zu befriedigen, steht im Zentrum der kom-menden LABORWELT-Ausgabe „DNA-Tech-nologien“ . Von DNA-Methylierung, neuen Sequencing-Tools bis RNAi und Werkzeugen zur experimentellen Funktionsanalyse bleibt kein Thema ausgespart, das für die Arbeitsgruppen und Unternehmen im sich wandelnden Markt eine Rolle spielt .

Marktübersicht: Lab AutomationWerbekunden bietet diese Ausgabe eine opti male Plattform für ihre Produkt-und Image anzeigen . Reservieren Sie Ihren Wer-beplatz in der LABORWELT-Themenausgabe bis spätestens zum 25 . März 2011 . Ergänzend zum Themenschwerpunkt „DNA-Technologi-en“ veröffentlichen wir eine Marktübersicht „Lab Automation“ . Informationen zu Ihrer möglichen Teilnahme gibt Oliver Schnell (Tel .: +49-30-264921-45, E-Mail: o .schnell@biocom .de) .

Vorschau Heft 2/2011

neuen Targets, Metabolitprofilen für neuartige gesundheitsfördernde Nahrungsmittel etc . gefahndet werden kann .

Kritische Masse

Jetzt wird klar, weshalb die Rote Biotechnologie von der kurz zuvor bekanntgebenen „Bioöko-nomie-Strategie“ der Bundesregegierung (vgl . LABORWELT 6/2010) ausgespart blieb .

Ob mit dem Programm, wie DKFZ-Chef Otmar Wiestler gegenüber Nature verkündet, indes „eine neue Ära für die biomedizinische Forschung in Deutschland“ anbricht, muss die Auswahl der Forscher und deren Output erst noch beweisen . Klar ist indes: Mediziner, Bio-logen und Firmen haben eingesehen, dass es besser ist „etwas zu haben, als nichts .“

50_LW1_11_Ausblick.indd 50 10.02.2011 12:19:37 Uhr

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Documents

LABORWELT 01/2011